雙波長法測定冰溫貯藏西洋參中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量

(黑龍江省農業科學院食品加工研究所,黑龍江哈爾濱 150086)

西洋參(PanaxquinquefoiumL.)為五加科人參屬多年生宿根性草本植物[1],既是名貴中藥材,又是保健食品的重要原料,具有降血壓、降血糖、免疫調節以及抗癌等多種生理功能,因有較高的醫療保健價值[2-7]。目前,市售的西洋參多以干品為主,鮮參僅在每年秋冬交替之際有短暫供應。鮮參的活性成分的含量和種類都大大優于干參,因此,鮮西洋參愈來愈受到人們的青睞[8]。然而,由于鮮西洋參采摘時間固定、貯藏時間較短、無法實現全年供應,因此嚴重地限制其在加工領域的應用。鑒于此,科研工作者們在西洋參保鮮技術方面進行了研究[9],付建國等[10]利用冰溫保鮮技術使西洋參保持鮮活狀態達到12個月以上,實現了鮮參的全年供應,這為鮮西洋參的加工利用提供了原料保障。冰溫保鮮技術是將包括果蔬、冷鮮肉和水產品在內的食品貯藏在冰點至0 ℃之間以實現延長其保質期的一種非凍結保鮮技術,其具有不損害食品細胞,有效抑制有害微生物的滋生以及最大程度的抑制食品細胞生命活動等特點[11]。淀粉是西洋參的主要組成成分,也是最主要的儲能物質。西洋參中的淀粉包括直鏈淀粉和支鏈淀粉,其含量和組成比例對西洋參營養功能與加工品質等都有一定的影響[12]。然而有研究表明,某些淀粉類植物在冰溫貯藏過程中,會通過呼吸作用消耗體內的淀粉[13],因此,測定冰溫貯藏過程中西洋參中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量變化有助于分析其保鮮品質和提出合理的冰溫保鮮模式。

目前,直鏈淀粉和支鏈淀粉的測定方法主要為碘比色法,而碘比色法又可分為單波長法、雙波長法以及多波長法[14],其中,單波長法因無法區分直鏈淀粉和支鏈淀粉,使得測定結果不夠準確[15];而多波長法雖能區分直鏈淀粉和支鏈淀粉,但方法相對繁瑣,應用性不強[16];雙波長法是近些年應用廣泛的測定方法[17],不但可有效的消除直鏈淀粉和支鏈之間吸收背景的交互影響[18],降低誤差[19],提高準確度[20],而且操作簡便、方法實用[21],具有準確度高和效率高等優點[22]。

因此,本文以冰溫貯藏的西洋參為原料,采用雙波長法建立西洋參中直鏈淀粉和支鏈淀粉的檢測方法,分析冰溫貯藏過程中西洋參中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量變化,為實現鮮西洋參的高品質加工利用提供理論和技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西洋參(四年生) 采自黑龍江省海林市;直鏈淀粉標準品(馬鈴薯源) 農業部谷物及制品質檢中心;支鏈淀粉標準品(馬鈴薯源) 上海源葉生物科技有限公司;氫氧化鉀、鹽酸、碘化鉀、碘、石油醚(60～90 ℃)、無水乙醇等 均為國產分析純。

BC/BD-379HN冰柜 青島海爾股份有限公司;CT410旋風磨 丹麥Foss公司;CARY100紫外分光光度計 美國Varian公司;DK-98-IIA電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;RLPHR1-4LSC真空冷凍干燥機 德國Martin Christ公司;3-18K冷凍離心機 德國Sigma公司;XS204分析天平、Seven Compact pH計 瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 西洋參的冰溫貯藏 挑選大小均一、完整無病害的西洋參放入內含塑料薄膜的泡沫箱內,再將含水量15%左右的泥沙和鋸末先后覆蓋在參體表面,然后將塑料薄膜封口、泡沫箱封箱,移置冰柜中,在泡沫箱上覆蓋一層棉被,并在冰柜上、中、下層分別放置電子溫度計,調節溫度至-8～-3 ℃進行冰溫儲藏。

1.2.2 雙波長測定直鏈淀粉與支鏈淀粉含量方法的建立

1.2.2.1 直鏈淀粉與支鏈淀粉標準物質純度確定 由于目前市售的直鏈淀粉和支鏈淀粉標準物質無法提供純度,因此需對其純度進行表征。參考石海信等[23]的方法,準確稱取2.5 mg直鏈淀粉和10 mg支鏈淀粉分別放入50 mL燒杯中,加入幾滴無水乙醇,再分別加入10 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液,80 ℃水浴加熱10 min至樣品充分溶解,搖勻后分別取出1 mL直鏈淀粉與支鏈淀粉溶液放于50 mL燒杯中進行顯色操作,再分別加入25 mL去離子水,以0.1 mol/L的鹽酸溶液調節pH至3.5,再分別加入0.50 mL碘試劑(含20 mg/mL碘化鉀和2 mg/mL碘)和0.08 g酒石酸氫鉀,將所獲得的溶液分別移至50 mL容量瓶中用去離子水準確定容,室溫靜止20 min,以相同質量濃度的碘溶液作空白,在波長400～800 nm范圍內進行光譜掃描,測定最大吸收波長λmax和該波長下的吸光度Amax,藍值的計算如公式(1)所示。

式(1)

式中,M為直鏈淀粉或支鏈淀粉質量濃度(mg/100 mL)。

1.2.2.2 直鏈淀粉和支鏈淀粉標準工作液的配制 準確稱取直鏈淀粉和支鏈淀粉各0.10 g,分別放入50 mL燒杯中,加入幾滴無水乙醇,再分別加入濃度為1 mol/L氫氧化鈉溶液10 mL,80 ℃水浴加熱10 min,至樣品充分溶解,然后將所獲得溶液移至100 mL容量瓶中,用去離子水準確定容,即得1 mg/mL直鏈淀粉和支鏈淀粉標準工作液。

1.2.2.3 直鏈淀粉與支鏈淀粉檢測波長確定和標準曲線繪制 分別準確吸取直鏈淀粉標準工作液1.60 mL和支鏈淀粉標準工作液2.00 mL,放于50 mL燒杯中按照1.2.2.1進行顯色操作,在波長400～800 nm范圍內進行光譜掃描,確定直鏈淀粉測定波長λ1和支鏈淀粉測定波長λ3,然后將直鏈淀粉和支鏈淀粉標準工作液掃描光譜疊加,繪制在同一坐標系里,采用等吸收點作圖法,確定直鏈淀粉參比波長λ2和支鏈淀粉參比波長λ4。

分別準確吸取直鏈淀粉標準工作液0.00、0.40、0.80、1.20、1.60、2.20、2.40、2.80 mL和支鏈淀粉標準工作液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50 mL放于50 mL燒杯中按照(1)進行顯色操作,以去離子水為空白,對不同濃度的直鏈淀粉工作液在λ1和λ2波長下分別測定吸光度值Aλ1和Aλ2,以ΔA直=Aλ1-Aλ2為縱坐標,直鏈淀粉標準工作液濃度為橫坐標,繪制直鏈淀粉的標準曲線,對不同濃度的支鏈淀粉工作液在λ3和λ4波長下分別測定吸光度值Aλ3和Aλ4,以ΔA支=Aλ3-Aλ4為縱坐標,支鏈淀粉標準工作液濃度為橫坐標,繪制支鏈淀粉的標準曲線。

1.2.2.4 樣品中直鏈淀粉與支鏈淀粉含量測定 分別將冰溫貯藏0、3、6、9、12個月的西洋參取出洗凈切片,然后進行真空冷凍干燥和粉碎過篩(80目)處理,得西洋參凍干粉。測鮮參含水率,記為W1。將西洋參凍干粉進行索氏提取脫脂處理(石油醚回流4 h),測脂肪含量,記為W2;精確稱取貯藏不同月份的脫脂西洋參凍干粉樣品0.10 g,分別放入50 mL燒杯中,加入幾滴無水乙醇,再分別加入濃度為1 mol/L氫氧化鈉溶液10 mL,80 ℃水浴加熱10 min,使樣品攪拌溶解,然后用去離子水定容至50 mL,靜置20 min后過濾,得供試樣品溶液。分別取5 mL供試樣品溶液放于50 mL燒杯中,按照1.2.2.1進行顯色操作,以去離子水為空白,在λ1、λ2、λ3和λ4波長下,分別測定各個樣品的吸光度,然后根據標準曲線,計算出樣品溶液中直鏈淀粉與支鏈淀粉的濃度。冰溫貯藏的西洋參中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的計算,如公式(2)和(3)所示。

直鏈淀粉含量(%)=[C直×50×50×(1-W1-W2)]/(5×0.10×1000)×100

式(2)

支鏈淀粉含量(%)=[C支×50×50×(1-W1-W2)]/(5×0.10×1000)×100

式(3)

式中,C直為樣品溶液中直鏈淀粉的質量濃度(mg/mL);C支為樣品溶液中支鏈淀粉的質量濃度(mg/mL)。

1.2.3 方法學驗證 穩定性試驗:將冰溫貯藏0個月的西洋參按1.2.2.4進行操作制備供試樣品溶液,每隔10 min測得和計算直鏈淀粉和支鏈淀粉的吸光度差值ΔA直和ΔA支,計算直鏈淀粉和支鏈淀粉的RSD值,考察樣品溶液的穩定性。

精密度試驗:將冰溫貯藏0個月的西洋參按1.2.2.4進行操作制備供試樣品溶液,重復6次,測得和計算直鏈淀粉和支鏈淀粉的吸光度差值ΔA直和ΔA支,計算直鏈淀粉和支鏈淀粉的RSD值,考察樣品溶液的精密度。

準確性試驗:將冰溫貯藏0個月的西洋參按1.2.2.4進行操作制備供試樣品溶液,測得和計算直鏈淀粉和支鏈淀粉的吸光度差值ΔA直和ΔA支,并計算供試樣品溶液直鏈淀粉和支鏈淀粉初始質量濃度;再分別向240 mL供試樣品溶液中分別加入10 mL濃度為0.05、0.1 mg/mL的直鏈淀粉標準工作液和0.2、0.3 mg/mL支鏈淀粉標準工作液,250 mL容量瓶定容,測得和計算加標后的直鏈淀粉和支鏈淀粉的吸光度差值ΔA直和ΔA支,并計算供試樣品溶液直鏈淀粉和支鏈淀粉加標后質量濃度,然后根據結果,計算直鏈淀粉和支鏈淀粉的加標回收率和RSD值,考察樣品溶液的準確性。

1.3 數據處理

每組實驗均進行三次平行實驗,測定結果以平均值±標準差表示,采用Excel 2010軟件進行統計分析,Origin 8.5軟件作圖處理。

2 結果與分析

2.1 直鏈淀粉與支鏈淀粉標準物質純度

藍值和最大吸收波長是反映淀粉與碘結合程度的重要指標,由于不同純度的淀粉與碘形成的復合物吸收峰存在一定的差異,因此,其也可作為直鏈淀粉和支鏈淀粉的純度表征的方法。直鏈淀粉與碘形成的復合物吸收峰波長一般在600～680 nm之間,藍值在0.8～1.2之間;支鏈淀粉與碘形成的復合物吸收峰波長一般在520～590 nm之間,藍值在0.08～0.22之間[24]。本文選用直鏈淀粉標準物質的藍值和最大吸收波長分別為1.092和630 nm,支鏈淀粉標準物質藍值和最大吸收波長分別為0.136和520 nm。因此,表明本文選用的直鏈淀粉和支鏈淀粉標準物質純度較高,可用來進行定量分析。

2.2 直鏈淀粉與支鏈淀粉測定波長的確定

分別對直鏈淀粉與支鏈淀粉標準工作液在400～800 nm進行光譜掃描,將二者掃描光譜圖疊加繪制在同一坐標系內,如圖1所示。依據雙波長法等吸收原理,采用作圖法確定直鏈淀粉測定波長為630 nm,參比波長為423 nm,支鏈淀粉測定波長為520 nm,參比波長為771 nm。

圖1 直鏈淀粉和支鏈淀粉測定波長和參比波長Fig.1 Determination wavelength and referencewavelength of amylose and amylopectin

2.3 直鏈淀粉與支鏈淀粉標準曲線的繪制

以直鏈淀粉濃度為橫坐標,以測定波長630 nm和參比波長423 nm下測得的吸光度的差值為縱坐標,繪制直鏈淀粉標準曲線如圖2,確定其回歸方程為:y=23.046x+0.0062,決定系數R2=0.998,表明在直鏈淀粉濃度0～0.056 mg/mL范圍內線性關系良好,符合比耳定律;以支鏈淀粉濃度為橫坐標,以測定520 nm和參比波長771 nm下測得的吸光度的差值為縱坐標,繪制支鏈淀粉標準曲線如圖3所示,確定其回歸方程為:y=2.5021x-0.0017,決定系數R2=0.997,表明在支鏈淀粉濃度0～0.070 mg/mL范圍內線性關系良好,符合比耳定律。

圖2 直鏈淀粉標準曲線Fig.2 Standard curve of amylose

表1 穩定性試驗結果Table 1 Results of stability experiment

表2 精密度試驗結果Table 2 Results of precision experiment

圖3 支鏈淀粉標準曲線Fig.3 Standard curve of amylopectin

2.4 方法學驗證

2.4.1 穩定性分析 穩定性試驗結果如表1所示,從表1可以看出,直鏈淀粉和支鏈淀粉溶液在測定時間10～60 min范圍內,測定值的相對標準偏差RSD值分別為0.96%和0.85%,二者均小于1%,并且10～30 min內測定結果基本穩定,說明試驗重復性良好,該方法測定結果相對穩定。

2.4.2 精密度分析 精密度試驗結果如表2所示,從表2可以看出,重復6次測定的直鏈淀粉和支鏈淀粉溶液含量平均值的相對標準偏差RSD值分別為0.89%和0.42%,二者均小于1%,因此,說明試驗重復性良好,該方法測定結果精密度較高。

表3 準確性試驗結果Table 3 Results of accuracy experiment

2.4.3 準確性分析 準確性試驗結果如表3所示,從表3可以看出,直鏈淀粉和支鏈淀粉測定的平均回收率分別為100.22%和100.19%,測定值的相對標準偏差RSD值分別為0.82%和0.62%,二者均小于1%,因此,說明試驗重復性良好,該方法測定結果準確性較高。

2.5 冰溫貯藏過程中西洋參直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量變化

冰溫貯藏過程中西洋參直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量變化如圖4所示。由圖4可以看出,隨著貯藏月份的增加,西洋參中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量均呈現小幅下降的趨勢,直鏈淀粉含量從2.84%下降到2.60%,而支鏈淀粉含量從7.13%下降到6.29%,這可能是因為西洋參在冰溫貯藏過程中仍然進行著各種生理活動,其中就包括蒸騰作用和呼吸作用。一方面,西洋參在冰溫貯藏過程中采取了保濕、保溫、避光等措施,使西洋參的蒸騰作用減弱,減少了水分的損失,另一方面,西洋參在冰溫環境下為了維持機體生命活動的正常進行,會通過呼吸作用消耗淀粉等能量物質而生成水,當呼吸作用大于蒸騰作用時,表觀呈現出淀粉含量的減少,這與賈愛軍等[13]在研究冰溫自發氣調貯藏對板栗淀粉含量影響時的結果相類似。

圖4 冰溫貯藏過程中西洋參直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量變化Fig.4 Contents change of amylose and amylopectinin American ginseng under ice-temperature storage

3 結論

本文為了測定冰溫貯藏西洋參中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量,采用雙波長法建立了直鏈淀粉和支鏈淀粉的檢測方法,通過方法學驗證實驗表明該法具有較高的穩定性、精密度和準確性,并且隨著貯藏月份的增加,西洋參中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量均呈現小幅下降的趨勢。因此,雙波長法適用于冰溫貯藏西洋參中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量的檢測,該方法的建立可有效的評價冰溫貯藏西洋參的加工品質,為進一步實現鮮西洋參的加工利用提供一定的借鑒作用。