雙層平板直接定性定量法檢測海產品中副溶血性弧菌

(寧波市食品檢驗檢測研究院,寧波 315048)

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌,生長在含鹽0.5%～8%的環境中[1-2],兼性厭氧,形態多為桿狀或彎曲狀,能夠在人畜間傳播,廣泛分布于海水、海產品及鹽漬食品中。該菌可引起食物中毒,導致腸胃炎等疾病,尤以日本、東南亞、美國及我國臺灣地區居多,也是我國沿海地區食物中毒最常見的致病菌之一[3]。近年來,由副溶血性弧菌引發的食物中毒事件占細菌性食物中毒的比例呈逐年上升趨勢[4],對人類的健康造成了很大的威脅。因此,對水產品中副溶血性弧菌檢測及監控顯得尤為重要。

隨著現代食品安全風險評估發展,食品微生物快速檢測技術由定性檢測逐步轉變為定性和定量檢測,微生物快速準確定量檢測已經成為未來發展的大趨勢[5]。目前現行的有效標準GB 29921-2013《食品中致病菌限量》規定水產制品(熟制水產品、即食生制水產品和即食藻類制品)中副溶血性弧菌采樣方案及限量為n=5,c=1,m=100 MPN/g,M=1000 MPN/g,檢驗方法為GB 29921-2013[6]標準中的定量檢測最大可能數(Most probable number,MPN)計數法。現有國家標準GB 4789.7-2013[7]中副溶血性弧菌定性檢驗選用硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽(Thiosulfate citrate bile salts,TCBS)瓊脂或弧菌顯色瓊脂。考慮到副溶血性弧菌菌落本底顏色與TCBS底色很接近,易導致漏檢,檢測靈敏度低[8]。相較于TCBS平板,副溶血性弧菌在弧菌顯色平板上菌落呈紫紅色,非目標菌不生長或顯現其它顏色,因此弧菌顯色平板具有較高的靈敏度和特異性[9]。近年來普遍采用生物技術如實時熒光定量PCR技術、多重PCR技術和免疫磁珠法等應用于環境及食品樣品中副溶血性弧菌數量的定量檢測[10-11],但是檢測對象是核酸片段,在檢測活菌同時也檢測了死亡細菌基因片段[11],因此不能如實反映樣品中活菌污染狀況,對于海產品而言,無法評價其受副溶血性弧菌污染的程度。

針對副溶血性弧菌檢測存在的問題,本研究采用雙層平板法對副溶血性弧菌直接定性定量,上層為溫和培養基對副溶血性弧菌起到壯大作用,下層為選擇性培養基抑制雜菌生長并突顯目標菌生長形態特征,從而對副溶血性弧菌計數并確認。本研究確定雙層平板法既可定量計數副溶血性弧菌,也可定性顯示細菌特征,從而建立一種方便快捷、穩定性強的副溶血性弧菌定性定量方法。此方法對熱處理、冷藏處理和冷凍處理的人工染菌樣品也具備良好的檢測效果,為食品安全風險評估提供技術支持,以期實現對副溶血性弧菌的監控,減少副溶血性弧菌帶來的食品安全問題。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ATCC 17802副溶血性弧菌標準儲備菌株 美國菌種保藏中心,-70 ℃保存于本實驗室;水產干制品魚片、腌制即食水產品泥螺 寧波市胖子海味有限公司;水產調味品海鮮粉 寧波今今調味食品有限公司;弧菌顯色培養基 法國科瑪嘉CHROMagar公司;3%氯化鈉堿性蛋白胨水(Alkaline peptone water,APW)、硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽(Thiosulfate citrate bile salts,TCBS)瓊脂、氯化鈉營養瓊脂(NaCl NA)、3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂(3% NaCl TSA)、3%氯化鈉三糖鐵瓊脂(3% NaCl TSI)、無鹽胰胨水、6% NaCl胨水、8% NaCl胨水和10% NaCl胨水 北京陸橋技術股份有限責任公司;革蘭氏陰性菌鑒定板條 美國BD公司;Vibrio快速檢測試劑盒 美國杜邦公司。

BAGMIXER 400均質器 美國Interscience公司;IF 750恒溫培養箱 德國Memmert公司;1378二級生物安全柜、902超低溫冰箱 美國Thermo Fisher公司;Phoenix M50全自動微生物鑒定系統 美國BD公司;BAX System Q7病原微生物快速檢測系統 美國杜邦公司;渦旋振蕩器 德國IKA公司;全自動革蘭氏染色儀 上海皓信生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 兩種雙層平板培養基的制備 參照文獻[12-13]制備雙層平板方法,NaCl TSA雙層平板的制備方法為:傾注10 mL弧菌顯色液體培養基倒入培養皿,待其冷卻凝固后作為下層培養基,再傾注5 mL 3% NaCl TSA液體培養基,待其冷卻凝固后作為上層培養基,即制成3% NaCl TSA雙層平板。4 ℃保存備用。

同樣方法制備NaCl NA雙層平板培養基,上層傾注5 mL NaCl NA液體培養基,待其冷卻凝固后作為上層培養基,即制成NaCl NA雙層平板。4 ℃保存備用。

1.2.2 菌株的培養與鑒定 副溶血性弧菌懸液的具體制作方法參考GB 4789.28-2013[14]制備副溶血性弧菌菌懸液,將ATCC 17802副溶血性弧菌標準儲備菌株接種到APW中(36±1) ℃培養18～24 h獲得副溶血性弧菌工作菌懸液。

參照GB 4789.7-2013[7]染色鏡檢、TCBS和弧菌顯色平板菌落特征觀察、生化檢測鑒定標準菌株。革蘭氏染色鏡檢:先用結晶紫進行初染,再用碘液媒染,然后用乙醇脫色,最后用番紅復染。TCBS和弧菌顯色平板采用劃線分離,(36±1) ℃培養18～24 h后觀察形態。初步生化鑒定:氧化酶試驗:挑取純培養的單個菌落進行氧化酶試驗;3% NaCl TSI試驗:挑取純培養的單個菌落轉種3% NaCl TSI斜面并穿刺底層,(36±1) ℃培養18～24 h后觀察結果;嗜鹽性試驗:挑取純培養的單個菌落,分別接種0%、6%、8%、10%不同氯化鈉濃度的胰胨水,(36±1) ℃培養18～24 h后觀察液體混濁情況。確定生化鑒定:用全自動微生物鑒定藥敏分析系統鑒定。

1.2.3 副溶血性弧菌直接定量檢測平板的篩選 副溶血性弧菌平板計數參照GB 4789.2-2016[15]略作修改:將副溶血性弧菌懸液在3% NaCl水中10倍連續梯度稀釋,選取稀釋度10-4和10-5,每個稀釋度分別吸取0.3、0.3和0.4 mL懸液分別接種于NaCl NA平板、NaCl NA雙層平板、3% NaCl TSA雙層平板、弧菌顯色平板和TCBS平板,然后置于副溶血性弧菌適宜生長溫度(36±1) ℃培養18～24 h,菌落計數和確認,并參照GB 4789.10-2016《第二法 金黃色葡萄球菌平板計數法》[16]法進行平板計數,根據2-ΔΔCt方法計算直接定量菌懸液濃度[17]。

1.2.4 副溶血性弧菌直接定量檢測平板的應用

1.2.4.1 試驗樣品本底檢測 參照GB 4789.7-2013[7],分別稱取魚片、泥螺和海鮮粉樣品25 g與225 mL APW充分均質混合,制成1∶10的樣品勻液增菌培養,樣品勻液于(36±1) ℃培養8～18 h。然后采用BAX System Q7[18]快速檢測系統分別對增菌培養后的試驗樣品本底值進行檢測,同時以副溶血性弧菌懸液和無菌3% NaCl水分別作為陽性對照和陰性對照,并制作結果曲線。

表1 副溶血性弧菌確定生化鑒定結果Table 1 Definitive biochemical result of Vibrio parahaemolyticus

注：+:陽性;-:陰性;V:可變。

1.2.4.2 人工染菌樣品的制備及平板計數 將等量的2.0×106CFU/mL副溶血性弧菌懸液接種于已粉碎的魚片、泥螺和海鮮粉樣品,制為人工染菌樣品,并參照GB 4789.2-2016[15]方法并略作修改測定副溶血性弧菌濃度。分別取人工染菌樣品25 g,加入3% NaCl無菌水225 mL均質混合,選取稀釋度10-4和10-5,每個稀釋度分別吸取0.3、0.3和0.4 mL樣品勻漿液接種NaCl NA平板和NaCl NA雙層平板,(36±1) ℃培養18～24 h后,計算每克人工染菌樣品中細菌菌落形成單位(Colony forming units,CFU)數量。

1.2.4.3 不同溫度處理樣品在副溶血性弧菌直接定量檢測平板的效果 依據1.2.4.2制備的人工染菌水產干制品魚片,參照黃靜敏等[5]方法,分別進行以下處理:50 ℃水浴熱處理樣品20 min,4 ℃冷藏處理樣品2 h,-18 ℃冷凍處理樣品24 h,分別檢測其中副溶血性弧菌CFU數量。

1.3 數據處理

數據處理和分析采用OriginLab V8.0分析軟件。

2 結果與分析

2.1 副溶血性弧菌標準菌株的鑒定

副溶血性弧菌菌落在TCBS平板上呈圓形、半透明、表面光滑、綠色菌落,輕觸有類似口香糖質感,弧菌顯色培養基上呈淡紫色菌落,均符合副溶血性弧菌的典型特征[7]。初步生化鑒定結果表明,氧化酶試驗陽性,染色鏡檢為革蘭氏陰性菌,3% NaCl TSI瓊脂反應結果為底層變黃不變黑、無氣泡、斜面顏色不變、有動力,嗜鹽性試驗結果在無鹽胨水和10% NaCl胨水中不生長,在6% NaCl胨水和8% NaCl胨水中生長旺盛(圖1)。經全自動微生物鑒定藥敏分析系統鑒定為副溶血性弧菌(表1)。覃玉英等[19]通過研究鑒定的菌株具備在TCBS平板上呈現表面光滑、綠色的菌落,氧化酶試驗陽性,在6% NaCl胨水和8% NaCl胨水中生長旺盛,在無鹽胨水和10% NaCl胨水中不生長等特征,最終鑒定為副溶血性弧菌菌落,本研究結果與其相似。

圖1 副溶血性弧菌初步生化鑒定結果Fig.1 Preliminary biochemical result of Vibrio parahaemolyticus

2.2 直接定量檢測平板的篩選

如圖2所示,以NaCl NA平板為對照,NaCl NA雙層平板和3% NaCl TSA雙層平板上菌落數量無顯著性差異,并且平板上均顯示副溶血性弧菌典型的中等大小、淡紫色菌落,而弧菌顯色平板和TCBS平板上菌落數量顯著減少。單純使用弧菌顯色平板涂布菌落計數結果與對照NaCl NA平板方法計數結果偏差較大,而NaCl NA雙層平板上的菌落計數結果與對照NaCl NA平板方法無顯著性差異,與王媛等[12]研究結果一致,并且細菌代謝產物滲透到下層弧菌顯色培養基顯示特征性的紫紅色,既能方便快捷識別目標細菌,又具備計數菌落的作用。

圖2 不同培養基上副溶血性弧菌菌落形態Fig.2 Colony morphology of Vibrio parahaemolyticus on plates

在檢測過程中,NaCl NA雙層平板上出現典型菌落約需18 h,而3% NaCl TSA雙層平板出現典型菌落約需20 h,兩者計數菌落均與對照NaCl NA平板計數方法無顯著性差異,但是副溶血性弧菌典型菌落在NaCl NA雙層平板出現時間更短,故選用NaCl NA雙層平板作為副溶血性弧菌直接定量計數優勢平板。

圖3 不同平板上副溶血性弧菌計數測定結果Fig.3 Counting result of Vibrio parahaemolyticus on plates注:以NaCl NA平板上的菌落記為“1”,其他結果均以此為比較的相對量;*表示與對照NaCl NA平板相比差異顯著,P<0.05。

2.3 試驗樣品本底檢測結果

將水產干制品魚片、腌制即食水產品泥螺和水產調味品海鮮粉與APW均質混合,增菌培養后,采用BAX System Q7檢測本底,檢測結果均顯示三種樣品不含副溶血性弧菌(圖4)。

2.4 直接定量檢測人工染菌樣品

采用NaCl NA雙層平板直接定量檢測人工染菌的水產干制品魚片、腌制即食水產品泥螺和水產調味品海鮮粉中副溶血性弧菌。由圖5可見,NaCl NA平板和NaCl NA雙層平板分別直接定量檢測人工染菌的三種樣品中細菌數量均無顯著性差異,說明NaCl NA雙層平板同NaCl NA平板均適用于海產品中副溶血性弧菌的定量檢測,王媛等[12]也有類似的研究結果。

圖5 直接定量檢測人工染菌樣品結果Fig.5 Direct quantitative detection of artificial bacterial samples

2.5 雙層平板法直接定量檢測溫度影響樣品效果評價

研究表明,副溶血性弧菌處于溫度低于5 ℃時,其生長受到抑制甚至死亡[1,11,20]。為如實反映副溶血性弧菌在低溫條件下的污染情況,采用NaCl NA雙層平板直接定量檢測人工染菌水產干制品魚片中副溶血性弧菌。如圖6可見,與室溫人工染菌樣品的對照組相比,50 ℃熱處理20 min的樣品中副溶血性弧菌濃度無顯著性差異,但是4 ℃冷藏處理2 h和-18 ℃冷凍處理24 h的樣品中副溶血性弧菌濃度顯著減少,分別是對照組的68.9%和21.7%。研究報道副溶血性弧菌不同菌株分別在5 ℃和-18 ℃低溫貯藏條件下存活率均顯著下降[21],并且-18 ℃比4 ℃更有利于快速滅活海產品中的副溶血性弧菌[22]。

本研究進一步證實了副溶血性弧菌處于溫度4和-18 ℃時,其生長會受到抑制,由此可見雙層平板法能夠反映樣品受污染情況,表明此方法靈敏性較好。

圖6 直接定量檢測溫度處理樣品的結果Fig.6 Direct quantitative detection oftemperature-treated samples注:*代表與室溫相比差異顯著,P<0.05。

3 結論

本研究顯示NaCl NA雙層平板法可以用于副溶血性弧菌的定性定量檢測,既能反映樣品受污染狀況,又能在平板上顯示菌落獨特的顏色,方便鑒定計數,相比于分子檢測方法也不需要高昂的儀器設備和試劑耗材,由此可見,NaCl NA雙層平板法直接定量計數適合廣泛的應用。