蝦夷扇貝抗氧化酶SOD和CAT與活品貯藏穩定性的關聯

周晏琳,劉 洋,李亞烜,閆麗新,田元勇,劉俊榮

(大連海洋大學食品科學與工程學院,遼寧大連 116023)

貝類是我國主要海水養殖品種,根據中國漁業統計年鑒,2017年我國養殖貝類產量1437萬余噸,其中,扇貝產量占200萬噸[1]。貝類活品流通過程中風味品質會持續下降,嚴重影響其經濟價值。冷卻干藏是活品貝類流通的重要方式之一。近年來,針對貝類捕后品質變化機制的研究陸續見報道。團隊研究發現菲律賓蛤仔在其采捕后至加工凈化前是其風味品質的易逝期,急性脅迫會導致蛤仔風味急驟下降。

蝦夷扇貝是我國北方最重要的經濟品種,目前針對捕后的活品蝦夷扇貝主要研究內容包括生化代謝、風味變化、菌群結構、免疫因子等[2-4],近年來,國內外關于貝類抗氧化酶的研究主要圍繞海洋環境監測、貝類生長過程中養殖環境脅迫及抗氧化體系探索等方面[5-6]展開,而對于采捕后易逝期內抗氧化酶與活品貯藏穩定性關聯的研究較少。如鄭堯等人對捕后活品蝦夷扇貝的流通調研發現,離水的扇貝從捕撈到凈化的流程為捕撈船、運輸船、港口、緩沖池、凈化池,此階段為其易逝期,免疫因子出現應答。在此期間,活體頻繁暴露會造成缺氧等脅迫,此外還有其他脅迫因素的影響如溫度、壓力、機械振動等[2]。

在捕后運輸過程中,扇貝受到脅迫時會產生氧自由基等物質對機體會產生損傷(包括脂質、DNA、蛋白質等方面)[7],其體內的超氧化物歧化酶(SOD)迅速作出應答,發生歧化反應將其分解成過氧化氫,過氧化氫進而會在谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)及過氧化氫酶(CAT)等的作用下分解為水和氧氣,從而消除氧自由基等對機體的影響。前期針對干露對活品蝦夷扇貝閉殼肌SOD酶活性影響的研究表明,溫度和氧氣對捕后活品蝦夷扇貝的保活有較大影響,同時閉殼肌中的SOD產生應答[8]。

為探究流通過程中活品蝦夷扇貝抗氧化酶活性與其貯藏穩定性的關聯,以蝦夷扇貝為研究對象,探究其貯藏過程中不同軟體組織的超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性、失重率、pH、糖原含量、ATP及其關聯化合物含量的變化,以此判斷活品蝦夷扇貝的抗氧化酶活性變化是否能作為扇貝活品品質變化的指標。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

活品蝦夷扇貝 于2018年4月10日購自獐子島集團股份有限公司,為當日采捕的底播養殖蝦夷扇貝,重量為(122.95±22.88) g/只,殼高(10.68±0.29) cm,殼長(10.65±0.32) cm,殼寬(2.31±0.18) cm;氫氧化鉀 (優級純)天津市科密歐化學試劑有限公司;Tris、無水乙醇、氯化鉀、葡萄糖、碘乙酸鈉、蒽酮、HCl、濃硫酸等試劑 皆為分析純。

800 s勻漿機 美國WARING公司;HG-200均質機 日本HSIANGTAI公司;高速離心機 德國HERMLE Labortechnik GmbH公司;UV-1800PC紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;PHS-3C精密pH計 上海精密科學儀器有限公司;Synergy H1酶標儀 美國伯騰儀器有限公司。

1.2 實驗方法

樣品冷卻干藏:扇貝到達實驗室后分為3組(每組10扇貝)并于4 ℃下干藏3 d,用海水浸濕的布覆蓋(每24 h更換一次)。

采樣及處理:分別于第0、1、及3 d進行采樣,取10個活貝,迅速開殼,將各個軟體組織分離(包括外套膜、性腺、橫紋肌、鰓、內臟團)后勻漿(10000 r/min,30 s),用液氮速凍,于-40 ℃下貯藏用于后續研究扇貝各組織的抗氧化酶活、閉殼肌的pH、糖原含量等生化指標。

1.3 指標測定

1.3.1 扇貝失重率測定 分別稱量扇貝貯藏前后的質量。失重率的計算方法如下:

1.3.2 閉殼肌生化指標測定

1.3.2.1 pH 取2.0 g肌肉勻漿加入10 mL 20 mmol/L碘乙酸鈉,迅速用玻璃棒充分攪拌,靜置25 min后測定pH,每組設3個平行。

1.3.2.2 糖原含量 參考許益民[9]的方法,取2.0 g肌肉勻漿加入4 mL 30% KOH溶液,沸水浴消化20 min。冷卻后加入20 mL無水乙醇,離心(3000×g,15 min)后取沉淀,用蒽酮比色法測定糖原含量,每組設3個平行。

1.3.2.3 ATP及其關聯物(ATP、ADP、AMP、AdR)含量 提取方法:參考Hu等[10]的方法,取1.0 g肌肉勻漿,加入10 mL 5% PCA溶液,用2 mol/L KOH調pH至2.0～3.5后定容至20 mL,離心(3000×g,5 min)取上清后用0.45 μm濾膜過濾,取4 mL濾液加1 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖溶液(pH7.5),于-40 ℃下貯藏以待后續分析,每組3個平行。

標準溶液的配制:分別稱取ATP、ADP、AMP和AdR標準品20 mg,加入少量超純水超聲溶解,再將6種標準品溶液混合定容至100 mL,即為200 μg/mL的標準品混合溶液,并依次稀釋為100、50、25、10、5、1、0.5、0.1 μg/mL的標準品混合液。色譜分析:采用高效液相色譜法分析。色譜柱為大連依利特公司(SinoChrom ODS-BP 5 μm,4.6 mm×250 mm);檢測器:二極管陣列檢測器(DAD);檢測波長:254 nm;溫度:35 ℃;流動相流速:0.7 mL/min;進樣量:20 μL。流動相A:0.05 mol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液(pH6.5),流動相B:流動相A:甲醇溶液(8∶2)。

1.3.3 粗酶提取與活性測定

1.3.3.1 粗酶提取 分別取外套膜、性腺、橫紋肌、鰓、內臟團勻漿各2.0 g,加入5倍體積的0.1 mol/L NaCl 20 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.5)。迅速在10000 r/min下均質3次,每次均質30 s,間隔30 s后離心10 min(10000×g,4 ℃),取上清夜即為粗酶提取液,整個操作過程在低溫下進行。粗酶蛋白含量用雙縮脲法進行測定[11]。

1.3.3.3 CAT酶活測定 參考Vinagre等方法測定CAT酶活力[12]。CAT能將H2O2分解成H2O和O2,通過在240 nm下動力學測定H2O2的吸光度的變化測得CAT酶活,每組設3個平行。CAT酶活定義:組織蛋白每分鐘分解1 mg H2O2的酶量。

1.4 數據處理

試驗結果均以平均值±標準差表示,試驗數據采用SPSS 18.0軟件進行處理,用單因素分析法進行方差分析,用Duncan法進行組間多重比較,顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 蝦夷扇貝活品干藏貯藏穩定性

2.1.1 干藏過程中失重率的變化 如圖1所示,活品蝦夷扇貝在貯藏過程中失重率明顯升高,在第3 d高達7%左右。本研究中發現,與原料扇貝相比,干藏扇貝可以觀察到其右殼(底殼)有明顯的液體析出積累現象,同時伴隨著外套膜收縮即所謂“縮邊”現象;推測是因為干藏過程與扇貝的生存環境完全不同,造成缺水、缺氧等脅迫導致貝體體腔液中水分析出,隨后逐漸蒸發而流失,扇貝以外套膜收縮的形式啟動了防御應答機制。貯藏過程中的失重對活品經濟價值有一定的影響。

圖1 干藏過程中活品蝦夷扇貝失重率的變化Fig.1 Mass loss rate of liveP.yessoensis during dry storage

2.1.2 干藏過程中閉殼肌pH的變化 貯藏過程扇貝閉殼肌pH的變化如圖2所示,原料初始pH為7左右,冷卻干藏貯藏1 d內,扇貝肌肉pH水平保持穩定;干藏3 d后,pH降至6.7左右(P<0.05),表明1 d內活體扇貝的品質保持較高水平,3 d后略有下降。與脊椎動物魚類不同,軟體動物的無氧代謝酸性產物除了源于糖原酵解產生的乳酸之外,還有源于其高能磷酸化合物即磷酸精氨酸代謝產物即章魚堿[13]。上世紀70年代,Doris等對扇貝(Placopectenmagellanicus)閉殼肌冰藏條件下的無氧代謝進行研究,觀察到能量代謝產物章魚堿的積累與閉殼肌pH下降有顯著關聯[14];對于貝類活品而言,貯藏條件決定了活體呼吸代謝方式,干藏條件下,活體進行無氧呼吸,Kawabe等對干藏牡蠣進行的研究,發現終極產物醋酸、丙酸或琥珀酸的積累同樣與牡蠣血淋巴的pH下降有關[15]。項目組劉慧慧等[16]的研究則發現,10 d的冷卻干藏,菲律賓蛤仔未發現pH下降趨勢,不排除是因為長時間干藏過程氨氮積累對pH下降產生的補償作用。

圖2 干藏過程中活品蝦夷扇貝閉殼肌pH的變化Fig.2 Changes of pH of live P. yessoensisadductor muscle during dry storage注:標有不同小寫字母者表示同一貯藏條件不同時間下有顯著性差異(P<0.05);圖3～圖6同。

圖3 干藏過程中活品蝦夷扇貝閉殼肌糖原含量的變化Fig.3 Changes of glycogen of liveP. yessoensis adductor muscle during dry storage

2.1.3 干藏過程中閉殼肌糖原含量的變化 干藏過程中扇貝閉殼肌糖原含量呈現顯著下降的趨勢(P<0.05),初始點閉殼肌的糖原含量在21.5 mg/g左右,在第3 d下降至19 mg/g左右,但整體依然維持在較高水平(圖3)表明在3 d內的冷卻干藏扇貝可以通過分解糖原維持機體正常運行,同時,結合其它生化指標的變化,在冷卻干藏1 d內扇貝的貯藏穩定性較好,至3 d后,貯藏穩定性有所下降。糖原是雙殼貝類重要的儲能物質和呈味物質,可以抵御冬季食物匱乏,能夠反映貝類的生長狀態[17]。在無氧初期,能量供應主要依賴糖酵解途徑,糖原降解產物為opines等物質[18]。在干藏貯藏條件下,扇貝受到嚴重的缺氧和饑餓脅迫,使其最先分解糖原以維持機體正常運行。Uzaki等對缺氧環境下菲律賓蛤仔代謝及糖原含量變化的研究發現,與含氧量正常條件下的蛤仔相比,在氧氣不足的條件下,蛤仔中的糖原含量呈現顯著下降的趨勢[19]。Hummel等在對處于干藏條件下兩種不同貝類的糖原含量的研究發現,在長期干藏過程中,糖原含量同樣呈現下降趨勢[17]。

2.1.4 干藏過程中閉殼肌ATP及其關聯物的變化 如圖4所示,冷卻干藏1 d內,扇貝肌肉ATP水平保持不變;干藏3 d后,ATP含量顯著降低(P<0.05),由3.8 μmol/g降至3.2 μmol/g左右,同時ADP顯著積累(P<0.05),目測扇貝生理狀態處于極度疲勞。期間,除少量AMP和AdR,其它ATP關聯降解產物均未檢出。ATP是為機體提供能量的重要物質,肌肉中的ATP含量能較好地反映扇貝的生理狀態,通常認為,ATP含量越高,扇貝的生理狀態越好[20]。經過冷卻干藏過程中各種因素的脅迫后,ATP依然能維持在較高水平,且未檢出其它降解產物,進一步說明1 d內扇貝的貯藏穩定性良好。魚類的ATP代謝途徑為ATP—ADP—AMP—IMP—HxR—Hx,而貝類不產生IMP,直接生成AdR[21],Ketut等在對冰藏10 d期間海洋無脊椎動物的ATP及其關聯物含量等變化的研究發現,只在牡蠣的肌肉和海膽的內臟中檢測到了AdR[22]。劉慧慧等針對菲律賓蛤仔的干濕藏保活特性的研究發現不同處理組的ATP及其關聯物會隨著蛤仔生理狀態的改變而改變[23]。楊文鴿對縊蟶在冰藏過程中的生化變化研究發現,ATP含量整體呈現下降趨勢,ADP和AMP維持在較高水平,對縊蟶鮮味的保持具有重要意義[24]。根據本研究結果,捕后初期24 h內的冷卻干露處置,活品仍保持很高的活力狀態,這對活品貯藏穩定性的探索極具積極意義。

圖4 干藏過程中活品蝦夷扇貝閉殼肌ATP及其關聯物的變化Fig.4 Changes of ATP and its related compounds oflive P. yessoensis adductor muscle during dry storage

2.2 蝦夷扇貝抗氧化酶及貯藏變化

2.2.1 蝦夷扇貝SOD及貯藏變化 基于各個軟體組織抗氧化酶分布特點,探索蝦夷扇貝抗氧化系統與活品貯藏穩定性的關聯。圖5為SOD分布及變化的分析結果,如圖5所示,對扇貝所有的軟體組織進行檢測,其中,雌雄扇貝的性腺分別進行檢測,發現各個組織均檢測到SOD活性在3 d內均出現顯著(P<0.05)變化,其中以鰓干藏第3 d的SOD酶活最高。同樣地,捕后初期1 d之內的冷卻干露處置,扇貝部分組織如橫紋肌等的SOD活性處于穩定狀態,干藏3 d后,由于劇烈脅迫導致各組織應激,各組織SOD活性出現增加。

圖5 干藏過程中活品蝦夷扇貝軟體組織SOD的變化Fig.5 Changes of SOD activity of liveP. yessoensis soft tissues during dry storage

2.2.2 蝦夷扇貝CAT及貯藏變化 圖6為扇貝各軟體組織CAT酶活的變化,同樣的,各組織均檢測到CAT活性,在捕后初期1 d內冷卻干露處置,扇貝部分組織如橫紋肌等的CAT活性相差不大,處于穩定狀態。干藏3 d后鰓的CAT酶活顯著(P<0.05)降低,可能是因為經SOD分解的H2O2一部分會被過氧化物酶分解從而影響其活性,也可能是因為到貯藏后期,一些未及時清除的自由基對相應的細胞產生了不可逆的損傷使其酶活降低,除鰓外,其余各組織的酶活顯著升高(P<0.05)。

圖6 干藏過程中活品蝦夷扇貝軟體組織CAT的變化Fig.6 Changes of CAT activity oflive P. yessoensis soft tissues during dry storage

本研究結果表明,捕后早期的冷卻干露處置,活品品質處于穩定狀態。由于扇貝原料為當日人工潛水采集,與大規模商業拖網相比,扇貝處于最佳捕后狀態。盡可能的降低各種脅迫因素的影響可提高扇貝的貯藏穩定性。

扇貝為無脊椎動物,其體內僅具有血細胞介導的較為完善的非特異免疫系統[25],超氧化物歧化酶和過氧化氫酶是其體內抗氧化機制中重要的酶類抗氧化劑,當機體受到環境脅迫時,SOD和CAT能迅速作出應答,因此其酶活性的變化在一定程度上能反映扇貝免疫機能的變化[26]。目前抗氧化酶活與環境溫度、污染程度等脅迫因素的應答已有研究,如Wang等對高溫等因素對櫛孔扇貝免疫應答的研究發現,29 ℃高溫脅迫下,扇貝血清中SOD出現應答,在96 h內呈現先上升后下降的趨勢[27]。Pavlovic等對暗體綠鰭魚(Chelidonichthysobscurus)內臟的抗氧化酶研究發現,海洋環境污染嚴重的地區,其內臟的SOD和CAT活性水平低[28],趙艷芳等[29]的研究發現,當櫛孔扇貝和菲律賓蛤仔受到不同的鎘脅迫時,內臟的SOD和CAT活性均出現應答,呈現先誘導后抑制的規律,王凡等[30]研究發現當櫛孔扇貝受到低濃度銅離子的脅迫時,其內臟團的SOD和CAT酶活呈現“抑制—誘導—抑制”的規律,但整體仍表現出抑制的特性。這些研究均表明抗氧化酶與生物所受脅迫存在一定的關聯。在本研究中,SOD和CAT酶活變化均呈現了良好的關聯性,但鰓中的CAT酶活變化仍需進一步結合其它過氧化物酶活性變化進行分析。

3 結論

蝦夷扇貝各軟體組織均檢測到SOD和CAT活性。冷卻干藏3 d后,缺氧等脅迫引起蝦夷扇貝免疫系統的應答,主要表現在各軟體組織SOD和CAT活性的顯著變化(P<0.05),其中以SOD應答尤為明顯,同時伴隨著冷卻干藏期間閉殼肌各項生化指標pH和糖原含量顯著(P<0.05)下降,ATP含量下降等。捕后初期1 d內的冷卻干露,活品依然能夠保持初始活品活力狀態,各項指標SOD、CAT、ATP、pH和糖原等均能維持在穩定水平。由此表明,捕后初期即易逝期是活品貝類品質關鍵控制期,易逝期內扇貝的處置與其恢復性的關系值得深入探索,或對活品貝類品質的控制極具科學意義。