酸魚產品中微生物群落結構與品質之間的關系研究

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(1.大連工業大學食品學院,遼寧大連 116034; 2.國家海洋食品工程技術研究中心,遼寧大連 116034)

酸魚是我國苗族、侗族等少數民族一種獨有的傳統佳肴,是華南地區的傳統發酵魚產品之一。酸魚不僅酸香濃郁、風味獨特、回味醇厚、貯藏期長,而且營養豐富,蛋白含量高,富含多種游離氨基酸,且脂肪含量低,因此深受人們的青睞,在我國、日本及東南亞等地具有很大的需求市場[1]。它主要由淡水魚、鯉魚或草魚與米飯或其他谷物、鹽和香料混合發酵而成[2],可炒食或放上辣椒煮成酸辣湯,味道鮮嫩爽口,使人食欲倍增。酸魚的制作以家庭作坊式的傳統工藝為主,一般分為小米發酵和辣椒發酵。發酵不僅可以去除魚肉的腥味、異味,還能賦予其特殊的風味[3]。傳統的加工方式使得酸魚的發酵周期長,工藝關鍵參數等的描述較為模糊,我國傳統固態發酵魚制品因地域、民族、加工方式不同而產生口味各異的品種[4]。利用植物乳桿菌發酵經過發酵的魚肉中庚醛、己醛、1-辛烯-3-醇等具有腥味的物質減少,具有奶香氣味的己酸、2,3-丁二酮、乙偶姻等物質含量增加[5]。Zeng等[6]在酸魚中接種發酵劑的發酵魚中乙醇和乙酸含量高于對照組,可以產生獨特的葡萄酒風味和適度的酸味,生成高含量的己醛。Lee等[7]在韓國魚醬中發現四聯球菌屬與風味有很大的聯系。目前,由于原料特性及民族風俗習慣的不同,發酵過程中微生物對發酵魚制品中風味物質的提升具有一定的影響。但對于不同市售酸魚產品的風味物質與微生物之間的相關性比較研究報道較少。

為研究酸魚中微生物群落對風味的影響,選擇具有代表性的2個省份(貴州、湖南)共8種樣品進行相關的指標分析,通過比較不同酸魚pH、乳酸、游離氨基酸及生物胺,并探究酸魚微生物群落的分布情況,采用頂空固相微萃取技術對不同酸魚產品的揮發性物質進行分析,分析微生物多樣性以及風味物質與微生物之間的相關性。該研究對品質評價和質量控制具有一定的科學依據,對發現優良發酵劑以及改善酸魚品質有一定的促進作用,為酸魚產品合理選擇提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

8個樣品 分別產于貴州、湖南兩省的不同產品,購自淘寶商家,樣品信息如表1所示;乳酸 生化試劑,上海生工生物工程有限公司;甲酸、三氯乙酸、乙酸銨、氨水、碳酸鈉、碳酸氫鈉 色譜純,美國阿拉丁工業公司;衍生緩沖液、平衡緩沖液 分析純,大連依利特分析儀器有限公司;甲醇 色譜純,上海麥克林生化科技有限公司;乙腈 色譜純,美國Spectrum化學試劑公司。

表1 不同酸魚產品的信息Table 1 Information on different products of Suanyu

FE28臺式pH計 梅特勒-托利有限公司;勻漿機 IKA;ICS5000型離子色譜儀 Thermo Fisher Scientific;4000QTRAP型液相色譜質譜聯用儀、7890A/5975C型氣相色譜質譜聯用儀 Agilent Technologiesc。

1.2 實驗方法

1.2.1 酸魚pH的測定 pH測定參考王利娟等[8]方法。

1.2.2 酸魚乳酸的測定 乳酸測定參照牟豪杰等[9]方法,采用離子色譜測定。

1.2.3 酸魚生物胺含量分析 參考Zeng等[10]的方法通過液相色譜質譜聯用測定。

1.2.4 游離氨基酸及的滋味活度值(TAV)測定

1.2.4.1 游離氨基酸的測定 參照李燕等[11]的方法采用高效液相色譜法測定。

1.2.4.2 TAV的測定 TAV法是一種基于閾值水平綜合評價滋味物質對食品整體貢獻的經典方法。滋味強度值為滋味物質濃度與該物質閾值的比值。

1.2.5 揮發性成分分析

1.2.5.1 前處理 準確稱取2.0 g魚肉樣品,蒸熟后搗碎放入20 mL頂空萃取瓶中,加入內標(50 μL,50 mg/mL環己酮)。密封后60 ℃水浴30 min,然后將萃取頭插入,吸附40 min后取出萃取頭,插入進樣口250 ℃解析5 min。

1.2.5.2 色譜條件 色譜柱為HP-5MS毛細管色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm)。升溫程序為30 ℃保持1 min,以4 ℃/min升至92 ℃,保持2 min;5 ℃/min升至200 ℃;0 ℃/min,6 ℃/min升至240 ℃,保持6 min;載氣流速(He)為1.5 mL/min;不分流模式進樣。

1.2.5.3 質譜條件 離子電離源,能量 70 eV;離子源溫度 230 ℃;四極桿溫度150 ℃。采集模式為全掃描,掃描范圍40～400 u。

1.2.5.4 香氣活性值(OAV) OAV 用于評價各香氣物質對酸魚香氣的貢獻,香氣活性值為香氣成分的含量與閾值的比值。

1.2.6 酸魚微生物分析 將8 g酸魚樣品剪碎裝入10 mL試管中,保存在-80 ℃。送百邁客生物科技有限公司提取基因組并測序。利用Illumina Hiseq測序平臺對樣品的基因組進行測序,得到原始數據。

1.3 數據處理

運用Canoco for windows 4.5進行冗余分析(RDA),采用Excel、SPSS 18.0進行數據處理。所有樣品均平行測定3次,采用ANOVA進行差異顯著性分析,以P<0.05為顯著。

2 結果與分析

2.1 不同酸魚產品pH、乳酸分析

表2 不同酸魚產品中生物胺含量Table 2 Biogenic amine content of different Suanyu products

注：同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),表3同。

對8種酸魚產品進行pH、乳酸指標的測定,結果見圖1。圖1A中不同酸魚產品的pH范圍在4.30～6.20之間,呈酸性的原因可能是碳水化合物的利用和隨后由細菌生產的有機酸,如乳酸[12]。pH呈現不同差異這可能是由于原料魚肉本身的pH可能存在差異。低pH通常被認為是保障發酵食品安全的一個重要因素[13]。Zeng等[14]在發酵低鹽酸鲊魚中的pH范圍在4.00～6.70。圖1B中不同樣品乳酸含量各不相同,差異較為顯著,含量在1.35%～3.74%。在本研究中乳酸積累量的不同可能是由于發酵條件或原料自身攜帶細菌的差異,使得發酵過程中乳酸菌的生長情況各異,從而產生不同含量的乳酸。

圖1 不同酸魚產品pH及乳酸含量Fig.1 pH value and lactic acidcontent of different Suanyu products注:不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05);數字“1～8”表示來自不同酸魚樣品的編號,圖2～圖4、表2～表5同。

2.2 不同酸魚產品生物胺含量分析

食品中的生物胺主要通過微生物脫羧酶的作用生成含氮化合物[15]。過量攝入時引起人體產生頭痛、血壓不穩、呼吸紊亂等不良反應,直至發生中毒[16]。表2為不同產地酸魚生物胺含量。可以看出在8種酸魚產品中共檢測到6種生物胺,分別是組胺、酪胺、尸胺、腐胺、色胺以及β-苯乙胺。有研究表明,人體攝入生物胺總量超過1000 mg/kg時會嚴重危害健康[17],本實驗2號酸魚中總生物胺的含量為447.33 mg/kg。其余7種產品的生物胺均低于200 mg/kg。7號中檢測出含量最少(13.91 mg/kg),遠低于危害人體健康的生物胺總含量,可能是由于原料肉中缺少了能夠產生氨基酸脫羧酶的微生物,導致生物胺的含量較少。酪胺和組胺是發酵魚制品中常見的生物胺[18]。酪胺的有毒劑量為100～800 mg/kg[19]。美國 FDA 要求進口海產品中組胺含量不得超過50 mg/kg[20]。在所有的樣品中檢測到酪胺的含量均低于224.56 mg/kg。8種樣品中的組胺最高為13.23 mg/kg。尸胺方面,購買的8種發酵酸魚中檢出3號樣品含量最高,為48.40 mg/kg,其含量遠低于Rabie等[21]在發酵魚肉中檢測的尸胺含量超過了200 mg/kg。綜上所述,檢測到酸魚樣品中生物胺含量最高為447.33 mg/kg,最低為13.91 mg/kg,8種市售酸魚總量,酪胺及組胺含量均在安全范圍內,且尸胺含量遠低于同類別發酵食品中含量。

2.3 不同酸魚產品游離氨基酸分析

不同酸魚產品的游離氨基酸含量及呈味特性見表3,共檢出18 種游離氨基酸,種類較豐富。在8種市售酸魚氨基酸總量均超過2000 mg/kg,具有顯著性差異,2號樣品含量最高為12905.79 mg/kg。酸魚都存在必需氨基酸(6種):賴氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、組氨酸。谷氨酸和天冬氨酸是很重要的鮮味物質,其含量是影響產品最終風味的重要依據[22]。呈鮮味谷氨酸方面,大于一半的酸魚樣品谷氨酸含量范圍為75.19～143.68 mg/kg,貴州產地的4號樣品含量最高(326.86 mg/kg),其次為6號。呈鮮味天冬氨酸方面,來自貴州產地的6號樣品含量最高,為54.57 mg/kg,8號樣品次之。

酸魚呈味特性除了與氨基酸的含量有關,還和滋味活度值有直接聯系,其值越大貢獻越大,反之亦然。呈味強度值大于 1,表明該氨基酸對酸魚滋味有顯著貢獻;呈味強度值小于 1,表明該味道不能被人體感知。由表4可知,在8種酸魚樣品中,2號樣品中7種氨基酸TAV大于1,其個數最多,說明2號中具滋味貢獻的氨基酸種類最多。呈鮮味天冬氨酸(Asp)在6號樣品中TAV值最高(0.05),呈鮮味谷氨酸(Glu)在4號樣品中TAV值最高(1.09),表明4,6號樣品中鮮味氨基酸對滋味的貢獻程度較大。

表3 不同酸魚產品游離氨基酸含量Table 3 Free amino acid contents of different Suanyu products

注：“-”表示未檢測到,表4～表5同。

表4 不同酸魚產品游離氨基酸的TAV值Table 4 TAV values of free amino acids of different Suanyu products

注：“閾值”是指在水溶液中的閾值。

2.4 不同酸魚產品揮發性風味物質分析

為了解酸魚的風味特點,對8種酸魚樣品進行揮發性物質分析。如圖2,8種樣品共檢出59種揮發性風味物質,包括醛類(6種)、酮類(3種)、醇類(16種)、酯類(10種)、酚類(3種、烴類(10種),表明市售8種酸魚產品揮發性風味較豐富。總含量來看,貴州產地的8號酸魚檢測到的風味物質更多一些。不同酸魚產品中各類揮發性風味物質相對含量各異(圖2),1號樣品中醛類物質為主導(61.2%),2、5、7號樣品中醇類物質均占主導,分別為44.9%、89.7%、77.8%。3、6、8號樣品中烴類物質占比最多,分別為43.8%、40.5%、45.3%,這一結果可能與發酵條件有關。醇類、醛類、烴類是酸魚產品中主要的風味物質。

表5 不同酸魚產品風味物質OAV值Table 5 OAV values of volatile compounds for different Suanyu products

圖2 不同酸魚產品各類揮發性風味物質相對含量對比及風味總量Fig.2 Comparison of relative content and flavor ofvarious volatile flavors of different Suanyu products

為了進一步明確市售不同酸魚產品中貢獻性揮發性風味物質,采用香氣活性值(OAV)進行評價。香氣化合物的OAV越大,說明其對整體香氣貢獻越大。表5是8種酸魚中揮發性物質OAV值表,共確定了25種揮發性化合物的OAV。將OAV>100作為挑選酸魚關鍵性風味物質的依據[25]。3-甲基-1-丁醇具有芳香氣味[26],庚醛呈清甜味[27],γ-松油烯呈松油、鐵銹味[28],作為小茴香的主要成分之一,它們可賦予產品獨特的香味。3-甲基-1-丁醇的OAV均大于10000,庚醛OAV均大于100,除7號(OAV=85.23)γ-松油烯在其余樣品中OAV>300,說明3-甲基-1-丁醇、庚醛、γ-松油烯是8種酸魚樣品的共性關鍵風味物質,其中3-甲基-1-丁醇對酸魚風味的貢獻最大。湖南產地的酸魚里特有的關鍵性風味物質有2種:戊醛、庚烷;貴州產地的酸魚里特有的關鍵風味物質有6種:反式2-己烯-1-醇、反式β-辛烯、α-松油醇、茴香酮、茴香腦、苯甲醛。這些風味物質的差別可能是由于所添加的香辛料及工藝導致,如貴州產地制作時常常添加的辣椒,而湖南產地一般僅采用小米發酵酸魚,并沒有添加過多的香辛料來增加風味,口味較為清淡。

2.5 不同酸魚產品微生物多樣性分析

圖3是8種酸魚的微生物在門水平及屬水平的的物種豐度結果,由門水平圖得到酸魚中的細菌群落歸屬8個門,分別為厚壁菌門(Firmicutes)、變形桿菌門(Bacteroidetes)、擬桿菌門(Proteobacteria),梭桿菌門(Fusobacteria)、螺旋體菌門(Saccharibacteria)、異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、酸桿菌門(Acidobacteria)。8種樣品在門水平具有相似的種群結構,酸魚樣品中厚壁菌門占主導地位(>85%),其次是變形桿菌門,相對豐度為0.7%～8.5%。酸魚中的細菌群落歸屬9個屬,乳桿菌屬(Lactobacillus)和四鏈球菌屬(Tetragenococcus)在酸魚樣品中為優勢菌屬,二者相對豐度之和為85%左右。此外,還有一些豐度相對較低的細菌,如魏斯式屬(Weissella)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、弧菌屬(Vibrio),相對豐度分別為0.1%～2.6%、0.05%～5.40%、0.003%～4.000%。乳桿菌是兼性厭氧菌,隨著發酵時間的延長,氧氣較少,仍能快速生長繁殖,在許多發酵食品中易形成優勢菌屬,四鏈球菌屬是嗜鹽微生物屬,在一些高鹽發酵食品中常被檢測到。據報道,韓國魚醬中,主要的微生物有乳桿菌以及四鏈球菌屬等[30]。Duan等[31]在蝦醬中也發現四鏈球菌屬,其豐度占細菌總數的95.1%。1、2、5號產品中四鏈球菌占44.9%～57.1%,1、2、5樣品在門水平具有相似的種群結構。7、8號四鏈球菌為主導菌(>86%)。3、4、6號乳桿菌屬為優勢菌屬(>80%)。因此在經過長時間的發酵后,最終酸魚中形成了以乳桿菌和四鏈球菌為優勢菌群的穩定群落結構。

圖3 不同酸魚產品細菌群落結構Fig.3 Bacterial community structure ofdifferent Suanyu products注:A:門水平;B:屬水平。

2.6 不同酸魚產品的微生物群落與環境因子相關性分析

采用冗余分析較好地描述了不同酸魚細菌屬與環境因子之間的相關性,結果表明主成分分別為RDA1:99.1%,RDA2:0.4%(圖4),表明主軸1、2解釋了酸魚群落結構中99.5%的變異,很好地反映出細菌屬與環境因子之間的關系。3、4、6號樣品中pH,天冬氨酸以及谷氨酸與乳酸桿菌呈正相關關系,與魏斯式菌及葡萄球菌屬成負相關關系。有研究在接種了混合菌種(Staphylococcusxylosus和Lactobacillusplantarum)的香腸中,游離氨基酸的含量隨著發酵時間逐漸增加[32]。結果表明乳酸桿菌的比例增加有助于酸魚中鮮味谷氨酸和天冬氨酸的釋放,從而形成較好的滋味,葡萄球菌和魏斯式菌可能對谷氨酸和天冬氨酸的生成產生不利影響。醛類物質閾值較低,賦予產品香氣能力較強,1、2、5號樣品中葡萄球菌和魏斯式菌與庚醛、苯甲醛呈正相關關系,據類似研究報道[33]葡萄球菌可以通過代謝生成苯甲醛等物質。說明葡萄球菌、魏斯式菌有利于促進酸魚中醛類物質的釋放,庚醛賦予酸魚清甜味。酸魚風味物質香氣活性分析可得3-甲基-1-丁醇、γ-松油烯兩種物質對酸魚風味貢獻最大,7、8號樣品中3-甲基-1-丁醇、γ-松油烯與四鏈球菌屬風味活性物質的生成具有正相關關系,與乳酸菌呈負相關。在韓國魚醬中也發現四聯球菌屬與風味有很大的聯系。王蔚新[25]研究表明植物乳桿菌可通過異型乳酸發酵降解亮氨酸等生成3-甲基-1-丁醇等風味物質。說明增加四聯球菌豐度有利于酸魚中共有關鍵性風味物質的釋放,賦予了酸魚中獨特的芳香氣味和松油香味。乳酸桿菌會減少酸魚中3-甲基-1-丁醇和γ-松油烯的生成。

圖4 酸魚中細菌群落與環境因子之間的冗余分析圖Fig.4 RDA analysis between bacterial communityand environmental factors in Suanyu

3 結論

8種酸魚產品的pH范圍為4.30～6.20,乳酸含量范圍1.35%～3.74%。8種市售酸魚中生物胺對人體健康不產生危害。酪胺,組胺含量在安全范圍內,且含量較低。酸魚中必需氨基酸有6種:賴氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、組氨酸。2號對滋味具有貢獻的氨基酸種類最多,4、6號樣品中鮮味氨基酸對滋味的貢獻程度較大。醇類、醛類烴類是酸魚中主要風味貢獻物質。3-甲基-1-丁醇、庚醛、γ-松油烯是8種樣品中共性關鍵性風味物質,分別呈芳香,清甜味,松油氣味。8種樣品在門水平具有相似的種群結構,酸魚主要的優勢細菌門均為厚壁菌門,主要的優勢細菌屬均為乳酸桿菌、四鏈球菌。冗余分析表明乳酸桿菌的增加有助于酸魚中鮮味谷氨酸和天冬氨酸的釋放。葡萄球菌、魏斯式菌有利于促進酸魚中醛類物質的釋放,庚醛賦予酸魚清甜味。增加酸魚中四聯球菌豐度有利于共性關鍵性風味物質的釋放,賦予了酸魚中獨特的芳香氣味和松油香味。乳酸桿菌會減少酸魚中3-甲基-1-丁醇和γ-松油烯的生成。綜合分析市售酸魚品質比較優良,不同酸魚產品群落結構呈現差異性,從而影響其揮發性風味物質的生成。發酵過程中應依據產品及風味要求選擇相應的發酵條件,以提高產品質量。