牛蒡不同部位多糖的抗氧化與抗凝血活性研究

王家輝,劉杉杉,張 鑫,王 振,李新朋

(臨沂大學藥學院,山東臨沂 276000)

本文對牛蒡根、莖、葉三個部位提取多糖的單糖組成和總糖含量進行測定,并對其抗氧化活性和抗凝血活性進行研究和比較,以此為基礎數據確定牛蒡各部位多糖的生物活性差異,以便于更好開發牛蒡多糖的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛蒡 采收時間為6月份中旬,山東省臨沂市某市場;木瓜蛋白酶(80萬 U/g) 北京索萊寶科技有限公司;甘露糖(Man)、葡萄糖氨(GlcN)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)和阿拉伯糖(Ara)標準品(標準品純度≥99%)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone,PMP,≥99%) 分析純,美國Sigma-Aldrich公司;三氟乙酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉 分析純,國藥集團;鄰苯三酚、硫酸亞鐵、DPPH、鐵氰化鉀 色譜純,美國Sigma-Aldrich公司;乙腈 色譜純,德國Merk公司;抗凝血試劑盒(APTT、PT、TT) 南京建成生物工程研究所。

HH-ZK4四孔水浴鍋 鄭州予華儀器有限責任公司;電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏儀器設備有限公司;Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Agilent 1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛蒡多糖的提取 取牛蒡根、莖、葉各部位水洗,置于干燥箱中,60 ℃干燥3 h,粉碎,過60目篩,用甲醇-乙酸乙酯(1∶2)混合液加熱回流脫脂[9]。脫脂產物經干燥后采用熱水提取牛蒡多糖,具體條件為:料液比為1∶20 (g/mL),100 ℃,時間為2 h。將提取混合物過濾,借助木瓜蛋白酶(4 mg/kg)去除蛋白質,透析(截留分子量為3500 Da),凍干(-80 ℃預凍,后于冷凍干燥機內凍干,-80 ℃),得牛蒡多糖粗品,稱重,計算提取率[10-11]:提取率(%)=凍干多糖粗品×100/投入量

1.2.2 單糖組成測定 采用PMP柱前衍生法測定牛蒡根、莖、葉三個部位提取多糖的單糖組成[12-13]。將三種牛蒡提取多糖分別配制成5 mg/mL的水溶液,取500 μL于西林瓶中,再加入500 μL、4 mol/L 三氟乙酸,封口。西林瓶置于115 ℃烘干箱中降解4 h。降解結束后,使用氫氧化鈉溶液調pH至中性,移取200 μL溶液用于PMP衍生。衍生時各樣品加入200 μL、0.3 mol/L的氫氧化鈉溶液,240 μL PMP-甲醇溶液,混勻后70 ℃水浴反應1 h。反應結束后,加入220 μL 0.3 mol/L的HCl溶液中和。加入1 mL氯仿萃取三次,過0.22 μm濾膜,高效液相色譜分析其單糖組成。單糖標準品:Man、GlcN、Rha、GlcA、Glc、Gal和Ara,配制成0.4 mg/mL的水溶液,取200 μL直接進行衍生即可,衍生方法與樣品相同。

HPLC色譜條件:色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈∶0.1 mol/L PBS溶液(pH=7.0)=18∶82 (v/v);流速:0.8 mL/min;進樣量:10 μL;檢測器:紫外檢測器(254 nm);柱溫:30 ℃。

1.2.3 總糖含量測定 采用苯酚硫酸法測定總糖含量[14]。配制標準溶液,后將標準溶液配制成不同濃度(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL),加入5%苯酚溶液1 mL,混勻后加入硫酸溶液5 mL,放置30 min后在485 nm下測定吸光度,得總糖含量標準曲線。將待測牛蒡多糖樣品配制成的溶液,取0.15 mL按上述條件測定,每個樣品平行測定三次,取平均值,根據標準曲線方程計算總糖含量。

1.2.4 抗氧化活性測定 選用抗壞血酸作為對照品,對比牛蒡根、莖、葉提取多糖0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL濃度下實驗結果,以表明其抗氧化活性強弱。

清除率計算公式:

式(1)

式中:A0為水代替多糖時測得的吸光度值;Ai為不同濃度待測多糖測得的吸光度值;Aj為水代替鄰苯三酚時不同濃度待測多糖測得的本底吸光度值。

1.2.4.2 羥基自由基(·OH)清除能力 采用硫酸亞鐵-水楊酸法測定牛蒡根、莖、葉三個部位多糖的羥基自由基清除能力[15]。依次向不同試管中加入6 mmol/L的硫酸亞鐵溶液1 mL、不同濃度的三個部位多糖溶液1 mL、6 mmol/L的過氧化氫溶液1 mL,搖勻后室溫靜置10 min,加入6 mmol/L的水楊酸溶液1 mL,搖勻后室溫靜置30 min,用蒸餾水調零,測定其在510 nm處吸光度值,計算公式見式(1)。

1.2.4.3 DPPH·清除能力 采用DPPH標準品-乙醇法測定牛蒡根、莖、葉三個部位提取多糖的DPPH清除能力[16-17]。依次向試管中加入不同濃度的三個部位多糖溶液0.500 mL,DPPH溶液3 mL,搖勻后室溫靜置30 min,用蒸餾水調零,測定其在517 nm處的吸光度值。

清除率計算公式:

式(2)

1.2.4.4 還原能力 采用鐵氰化鉀-三氯化鐵法測定抗壞血酸、牛蒡根、莖、葉三個部位多糖的還原能力[18],在不同試管中分別加入不同濃度的三種多糖溶液各1 mL,1%鐵氰化鉀溶液1 mL,搖勻后50 ℃水浴20 min,向反應體系中加入0.1%的三氯乙酸溶液5 mL停止反應,5 min后加入0.1%三氯化鐵溶液1.2 mL,搖勻后測定其在700 nm處的吸光度值。還原能力與吸光度值成正比。

1.2.5 抗凝血活性 通過測定活化部分凝血酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)評價其抗凝血活性[19-21]。測定過程均嚴格按照試劑盒說明書進行。采用半自動凝血儀檢測;多糖樣品用生理鹽水溶解;陽性對照選用濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL的肝素鈉,空白對照選用生理鹽水。

1.2.5.1 活化部分凝血酶時間(APTT) 依次向不同血凝杯中加入APTT試劑(液體白陶土)50 μL、血漿50 μL及不同濃度的三種多糖溶液50 μL,混勻后37 ℃孵育3 min,而后加入已預熱的氯化鈣溶液50 μL,立即混勻,記錄血漿凝固時間。每個樣品平行測定三次,取平均值。

1.2.5.2 凝血酶原時間(PT) 向不同血凝杯中加入血漿50 μL及不同濃度的三種多糖溶液50 μL,混勻后37 ℃孵育3 min,后加入已預熱的凝血酶原PT試劑100 μL,立即混勻。記錄血漿凝固時間。每個樣品平行測定三次,取平均值。

1.2.5.3 凝血酶時間(TT) 向不同血凝杯中加入血漿100 μL及不同濃度的三種多糖溶液100 μL,混勻后37 ℃孵育3 min,后加入已預熱的凝血酶TT試劑100 μL,立即混勻。記錄血漿凝固時間。每個樣品平行測定三次,取平均值。

1.3 數據的處理

對各樣品多糖的高效液相色譜圖中各單糖的峰面積進行積分測定單糖組成及相對含量,進而計算摩爾百分比。抗氧化活性和抗凝血活性實驗數據使用Graphpad Prism 6.0軟件整合[22]。

2 結果與分析

2.1 牛蒡多糖單糖組成及總糖含量測定結果

牛蒡根、莖、葉三個部位提取多糖的單糖組成經PMP柱前衍生法測定結果如圖1示(橫坐標為單糖出峰時間)。從圖1中可以看出,牛蒡根、莖、葉多糖中均含有不等量的Man、GlcN、Rha、GlcA、Glc、Gal和Ara,其摩爾比如表1所示。從表1中數據可看出,牛蒡根、莖、葉多糖的單糖組成摩爾比有明顯不同,其中牛蒡根中Glc含量最高,其次為GlcA和Gal;牛蒡莖中主要有Gal、Glc和Ara組成;而牛蒡葉中也是主要以Glc為主,Gal和Ara次之。

圖1 牛蒡多糖的單糖組成Fig.1 Monosaccharide composition ofArctium lappa L. polysaccharides

由單糖組成結果分析看出:牛蒡根多糖和牛蒡葉多糖主要以Glc為主,在測試總糖時以Glc為標準品,而牛蒡莖中主要以Gal為主,測試總糖以Gal為標準品(牛蒡根及牛蒡葉多糖測試標準曲線:y=1.9143x+0.0629,R2=0.997;牛蒡莖多糖測試標準曲線:y=4.5204x+0.1468,R2=0.998)。

結果顯示牛蒡根總糖含量最高(69.4%),其次為牛蒡葉(56.1%),而牛蒡莖的含量最低(56.1%),表明牛蒡中多糖整體含量比較高。三種多糖的提取率都比較高,超過10%,其中牛蒡根部多糖提取率最高(15.3%),而牛蒡莖的提取率最低(11.5%)。

表1 牛蒡多糖單糖組成、提取率及總糖含量(%)Table 1 The monosaccharide composition,yield and total sugar(%)

2.2 抗氧化活性測定結果

圖2 牛蒡多糖超氧陰離子自由基清除能力Fig.2 Superoxide anion free radical scavengingability of Arctium lappa L. polysaccharide

2.2.2 羥基自由基(·OH)清除能力 羥基自由基清除能力實驗結果如圖3所示。在濃度低于0.8 mg/mL時,牛蒡莖多糖清除能力隨濃度升高而明顯升高,當濃度高于0.8 mg/mL后,清除能力隨濃度變化的趨勢較小,與抗壞血酸相比差距較小。牛蒡根多糖的清除能力遠低于其余兩種多糖,在0～1.0 mg/mL濃度范圍內,清除率與濃度成正相關。三個部位提取多糖的羥基自由基清除能力以牛蒡莖最強,牛蒡葉次之,牛蒡根最弱。在濃度為1.0 mg/mL時,牛蒡根多糖清除能力僅為30%,而牛蒡莖與牛蒡葉清除能力分別在86%與95%,此濃度下,牛蒡莖多糖清除能力抗壞血酸差距極小。

圖3 牛蒡多糖羥基自由基清除能力Fig.3 Scavenging capacity of Arctium lappa L.polysaccharide on hydroxyl radicals

2.2.3 DPPH·清除能力 DPPH·清除能力實驗結果如圖4所示。牛蒡根、莖多糖在濃度低于0.8 mg/mL時,清除能力與濃度成正相關性,在濃度高于0.8 mg/mL后,清除能力不再隨濃度增加而升高。牛蒡葉在濃度低于0.4 mg/mL時,清除能力隨濃度升高而迅速升高,在濃度高于0.4 mg/mL后,清除能力變化不明顯。當濃度達到1.0 mg/mL時,三個部位多糖的DPPH·清除能力以牛蒡葉多糖最強,達到69%,牛蒡莖次之(51%),牛蒡根多糖最弱,為44%。牛蒡莖、根多糖間清除能力差距較小。牛蒡葉多糖的清除能力在濃度低于0.6 mg/mL時要遠高于其余兩種多糖,濃度高于0.6 mg/mL后,這一差距縮小。三種多糖的清除能力同抗壞血酸相比,差距較大,相差20%。

圖4 牛蒡多糖DPPH·清除能力Fig.4 DPPH scavenging capacity ofArctium lappa L. polysaccharide

2.2.4 還原能力 還原能力實驗結果如圖5所示。從圖中可以看出,各濃度下,牛蒡葉多糖的還原能力與其余兩種多糖相比略高,牛蒡莖多糖次之,牛蒡根多糖最弱,還原能力僅為0.3。牛蒡根多糖隨濃度升高還原能力逐漸升高,但升高趨勢較低;牛蒡莖多糖在濃度低于0.6 mg/mL時,還原能力隨濃度升高而升高,在高于0.6 mg/mL時,還原能力隨濃度升高反而呈略微下降趨勢;牛蒡葉多糖在0～1.0 mg/mL濃度區間內隨濃度升高還原能力一直升高,但在高于0.8 mg/mL后,升高趨勢略有降低。

圖5 牛蒡多糖還原能力Fig.5 Reduction capacity of Arctium lappa L. polysaccharide

2.3 抗凝血活性分析

2.3.1 活化部分凝血酶時間(APTT) 從圖6中可以看出,相較于肝素鈉,三種牛蒡多糖的APTT均較短(具有顯著性差異)。在0～0.3 mg/mL濃度區間內,隨濃度升高,各樣品APTT值也逐漸增大,當濃度為0.3 mg/mL時,牛蒡葉多糖的APTT時間最長,為35 s,而牛蒡根多糖次之,為29 s,牛蒡莖最短,僅為25 s。

圖6 牛蒡多糖對APTT影響Fig.6 Effects of Arctium lappa L. polysaccharides on APTT

2.3.2 凝血酶原時間(PT) 實驗結果如圖7所示。從圖中可以看出,牛蒡莖、葉多糖對PT值影響隨濃度變化幾乎不變,無明顯延長PT作用。牛蒡根多糖在濃度低于0.15 mg/mL時,PT隨濃度升高而逐漸升高,在高于0.15 mg/mL后,無明顯變化。低濃度下(小于0.15 mg/mL),牛蒡根多糖PT略大于肝素鈉PT,中高濃度下(大于0.15 mg/mL),肝素鈉PT遠大于牛蒡根多糖。

圖7 牛蒡多糖對PT影響Fig.7 Effects of Arctium lappa L. polysaccharides on PT

2.3.3 凝血酶時間(TT) 凝血酶時間實驗結果如圖8示。從圖中可以看出,0～0.3 mg/mL濃度間內,三種多糖的TT值隨濃度升高緩慢升高,各提取多糖間差距極小。在0.25～0.30 mg/mL范圍內,肝素鈉TT值驟然升高,遠高于三種多糖的TT值。三種多糖延長TT作用不明顯。

圖8 牛蒡多糖對TT影響Fig.8 Effect of Arctium lappa L. polysaccharide on TT

3 討論與結論

本研究首先采取傳統水提醇沉法提取牛蒡根、莖、葉三個部位的多糖,其中牛蒡根部多糖提取率最高(15.3%),相比于超聲波輔助熱水提取,收率明顯升高[23]。總糖含量分析也表明牛蒡根總糖含量最高。單糖分析顯示:三種多糖均含有不等量的Man、GlcN、Rha、GlcA、Glc、Gal和Ara,但單糖摩爾比有明顯不同。牛蒡根多糖中主要為Glc(57.3%),其次是Glc、Gal和Ara;而牛蒡莖多糖中Gal(28.6%)和Glc(26.5%)以及Ara(26.2%)含量相差不大;牛蒡葉多糖含量最高的為Glc(48.7%),其次是Gal和Ara,與此前的相關研究比較,果糖的存在值得更深入的研究[24-25]。抗氧化活性測試結果表明牛蒡莖多糖和牛蒡葉多糖抗氧化性要優于牛蒡根多糖。超氧陰離子自由基和羥基自由基清除實驗中可以看出,牛蒡莖多糖和牛蒡葉多糖表現出良好的抗氧化性,但相對于抗壞血酸還有一定的差距,但隨著濃度的增大,差距逐漸在縮小。而牛蒡根多糖對超氧陰離子自由基和羥基自由基清除能力最差。而在DPPH·清除實驗和還原能力測定實驗中,牛蒡葉多糖能力要更強,牛蒡莖多糖與牛蒡根多糖表現出的活性更相近,都遠低于抗壞血酸。綜合抗氧化活性測試結果可以發現,牛蒡葉多糖活性要強與牛蒡莖多糖,牛蒡根多糖抗氧化活性相對較弱。對比已有研究,牛蒡根多糖已表現出良好的抗氧化活性[26-27],但牛蒡莖與牛蒡葉多糖研究較少,三者之間抗氧化活性對比比較罕見,所以研究結果與本實驗結果有一定差距[28]。抗凝血活性測試結果表明所有牛蒡多糖樣品抗凝血活性均遠低于肝素鈉,且隨濃度(0～0.3 mg/mL)變化的趨勢較小,說明牛蒡多糖的抗凝血活性并不高。APTT測試中,牛蒡葉多糖的APPT長于牛蒡根多糖,牛蒡莖多糖相對最短;而PT和TT測試中牛蒡根活性稍好,但三者相差并不大,并沒有表現出良好的抗凝血活性。

本研究結果表明牛蒡多糖具有相對比較好的抗氧化活性,但不同部位提取的多糖在抗氧化活性上表現出差異性,其中牛蒡葉多糖效果較好,牛蒡莖次之,而牛蒡根多糖抗氧化活性最低,但在抗凝血活性測試中牛蒡多糖并沒有表現出良好的活性,相比于肝素鈉,三種多糖的抗凝血活性明顯較弱。然而由于牛蒡根多糖產量大,易于處理,所以在工業價值上更加優于牛蒡葉多糖。本研究結果為牛蒡葉多糖應用提供基礎數據,更有利于牛蒡葉多糖的工業開發。