靈芝孢子粉生物活性成分及藥理作用

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(1.浙江工業大學食品科學技術系,浙江杭州 310014;2.浙江百山祖生物科技有限公司,浙江麗水 323010)

靈芝(Ganodermalucidum)屬于擔子菌門擔子菌綱多孔菌科靈芝屬藥用真菌[1],具有很高的藥用價值,被廣泛應用于治療和預防多種心血管疾病、肝腎疾病、神經性疾病等常見的疾病[2]。盡管靈芝在我國具有非常悠久的藥用歷史,但是靈芝在成熟期從菌蓋彈射出來的淡霧狀、卵型生殖細胞即靈芝孢子直到二十世紀才得到認可和利用,靈芝孢子內含有靈芝子實體幾乎所有的活性物質,包含多糖類、三萜類、蛋白質、甾醇類、核苷類、微量元素等,且部分活性物質如總三萜、總多糖含量明顯高于靈芝子實體[3],同時在抗腫瘤[4]、抗氧化[5]、增強免疫力[6]等方面表現出更加明顯的效果,因此靈芝孢子粉已成為當前研究和開發的熱點,成為保健品市場上最受消費者青睞的產品之一。本文綜述了靈芝孢子粉的生物學結構、主要功能性成分、藥理作用的研究進展,以期為靈芝孢子粉的進一步研究和相關技術的開發提供理論參考。

1 靈芝孢子結構

靈芝成熟后子實體木質化,皮殼組織革質化,內壁為子實層,產生孢子。靈芝孢子是靈芝的有性生殖細胞,呈卵型,褐色,大小為(5.26～6.05) μm×(7.89～8.64) μm。1962年,法國科學家Heim提出了靈芝孢子由最外孢層、周孢層、外孢層、上孢層、內孢層五層結構組成的概念,但出于實際情況考慮,研究者們將其簡化為雙層壁結構,即由透明的外孢壁和淡黃色或酒紅色的內孢壁組成,在每個孢子的褐色內層產生許多針狀小突起,深深地伸入孢子壁的透明外層,外層孢壁光滑[7],中間是一個大油滴。靈芝孢子孢壁的主要成分為幾丁質,含量達52.08%～57.64%,含有Si、Ca、Fe、Mg等多種無機元素,其中Si(19.01%)和Ca(24.31%)的摻入使得孢壁更加結實堅硬,且耐酸堿,極難氧化分解,難以被人體消化分解和吸收[8-9],故靈芝孢子一般經過破壁處理后再進行食用或利用;靈芝孢子破壁后,孢子內的活性成分得以有效釋放,包含多糖類、三萜類、核苷類等主要的生物活性成分,脂質類物質是其主要的內容物,具有很高的抗氧化活性[10],通過有效的提取方法可達到20%以上的提取率[11];靈芝孢子多糖的含量受靈芝的種類和生長條件的影響而有所不同,含量在1%～4%之間[12-14];靈芝孢子的蛋白質含量達18%,其中必需氨基酸含量豐富[15]。

圖1 靈芝孢子結構示意圖Fig.1 The structure of G. lucidum spore 注:1:孢膜;2:外孢壁;3:孢間支柱;4:內孢壁;5:孢臍;6:細胞膜;7:原生質體;8:凹陷。

圖2 靈芝孢子三萜化合物6種基本結構Fig.2 6 kinds of basic structures of G. Lucidum spores triterpenoids

2 靈芝孢子粉有效活性成分

經相關研究表明,直接食用未經破壁處理的靈芝孢子粉,人體對其有效成分的利用率較低,而食用經破壁處理的孢子粉,利用率可達到95%以上,且破壁前后生物活性物質和有效成分含量均有一定的差異[16],因此,建立有效的靈芝孢子破壁方法可以促進對靈芝孢子粉中生物活性成分的提取以及藥物價值的研究。芝孢子粉的化學成分復雜,包含三萜類、核苷類、多糖類、維生素類、甾醇類、生物堿、無機微量元素等幾大類,其中多糖類、三萜類、核苷類和生物堿類化合物具有不同程度的生物活性和藥用價值,也是當前國內外學者研究的熱點。

2.1 三萜類

三萜類化合物是靈芝孢子粉的主要活性成分之一,難溶于水,通常具有苦味,根據研究報道已經從靈芝和靈芝孢子油中發現300余種三萜類化合物[17]。三萜類化合物結構較為復雜,分子量為400～600 Da,具有六種基本結構,根據碳骨架上所含官能團種類及支鏈的不同,可分為靈芝酸類、醛類、醇類、內酯類等[18-19],其多樣性的結構,賦予了靈芝孢子粉廣泛的生理活性和藥理作用。

于華崢等[20]比較了靈芝子實體、菌絲體和孢子粉中幾種化學成分的差異,對其中靈芝三萜的HPLC指紋圖譜進行了相似度分析,發現靈芝孢子粉的三萜類化合物集中在孢壁內。譚洪升等[21]采用高氯酸顯色法測定和比較了靈芝子實體和破壁靈芝孢子粉中三萜類物質的含量,結果表明破壁靈芝孢子粉中的三萜類化合物的含量高出靈芝子實體中的三萜化合物3倍以上。靈芝孢子油是通過一定手段從破壁靈芝孢子粉中萃取的脂質物質,主要成分有三萜類化合、甾醇和不飽和脂肪酸,楊文婧等[11]研究對比了多種提取法提取破壁靈芝孢子油,通過正交實驗優化得到通過超臨界CO2萃取靈芝孢子油的最佳條件,在此條件下靈芝孢子油的得率為24.63%,其中三萜類化合物的含量為25.12%。

2.2 多糖類

靈芝多糖是靈芝孢子粉的主要活性成分之一,是靈芝的主要次生代謝產物之一,目前已從靈芝子實體、菌絲體、孢子粉、發酵液中提取分離出多種不同種類的多糖[22-23],因其良好的抗腫瘤活性已成為國內外學者的研究熱點。靈芝多糖種類較多,目前己分離到的有200多種,結構復雜,靈芝孢子粉多糖包括以β-(1→6)-D-葡聚糖為主鏈的多糖、線性(1-3)-α-D-葡聚糖和以β-糖苷鍵鏈接的中性雜多糖,其分子量差異性較大,一般都以104Da為數量級,其單糖組成多以葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、巖藻糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖7種單糖為主[24],差異性主要體現在其組成比例、糖苷鍵和肽鍵結合方式及數量上的不同[25-26]。

黃曉蘭等[16]研究了多種提取方法提取靈芝孢子粉多糖,結果表明破壁后的靈芝孢子粉多糖含量是未破壁的1.7倍,單糖組成相同。張芝華等[27]通過高效陰離子色譜法測定了五種不同來源的靈芝孢子粉中的單糖組成,結果表明,不同來源的靈芝孢子粉中單糖組成種類大致相同,以葡萄糖、半乳糖、甘露糖為主,但其比例存在較大差異,總糖在2.05%～4.97%之間。

2.3 核苷類

核苷類成分是靈芝孢子粉中重要的活性成分之一,核苷類化合物包括腺苷、腺嘌呤、蟲草素、尿苷、鳥苷、鳥嘌呤等15種,具有明顯的藥理活性,如抗凝血、鎮靜中樞神經等作用[28]。王金艷等[29]采用高效液相色譜法對4個產地的靈芝孢子粉中的核苷類成分的種類和含量進行了測定,其研究結果顯示尿苷,鳥苷,腺苷三種核苷物質在4個產地的靈芝孢子粉中的含量均較高,由此可以推斷其是靈芝孢子粉中的主要核苷成分。除此以外,靈芝孢子粉產地的環境因素[29]、成熟階段不同的產粉時間[30]對其中核苷類成分的組成和含量具有較為顯著的影響。

2.4 無機元素

靈芝孢子粉中含有豐富的無機元素,不同品種靈芝中元素的種類和含量存在一定差異,同生長期的靈芝孢子粉無機元素含量存在明顯差異[31]。靈芝孢子粉中含有25種元素,其中Ca、Mg、P、Fe、Zn、Cu、Ni、Co、Cr、Mo、Li、B、V、Sn、Ge、Sr、Ti、Se等19種為人體必需或有益的常量或微量元素,我國人群中比較容易缺乏的主要是Ca、Fe、Zn、Se和I,靈芝孢子粉中Ca、Fe、Zn含量相對較高,食用靈芝孢子粉能夠在一定程度上彌補日常膳食中營養元素攝入不足的情況[32-33]。徐靖等[34]通過電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)測定和比較了不同破壁方法得到的靈芝孢子粉中的無機元素含量,表明不同破壁方法對無機元素含量的影響較大,靈芝孢子粉中Mn、Fe、Cu、Zn含量較為豐富。胡曉等[35]利用ICP-MS測定了20個產地來源的靈芝孢子粉中的重金屬含量,結果顯示不同產地靈芝孢子粉之間的重金屬含量均無較大差異,并且不同破壁方法不會影響靈芝孢子粉中的重金屬含量。

2.5 生物堿

生物堿是一類含有堿性氮原子的雜環化合物,靈芝孢子粉中生物堿類主要有甜菜堿(betaine)及其鹽酸鹽,膽堿(Choline),煙酸(Nicotinic acid),靈芝堿甲(Ganoine)、靈芝堿乙(Ganodine)等,這些物質在靈芝孢子粉中的含量較低,但其能夠起到重要的功效和作用,如膽堿具有良好的促進腦部發育、提高記憶能力、調控信息傳遞的作用[36]。王亞濤等[37]建立了一種運用高效液相色譜-蒸發光散射檢測器(HPLC-ELSD)測定靈芝子實體和孢子粉中膽堿含量的方法,其結果顯示同產地的靈芝孢子粉中膽堿的含量顯著高于靈芝子實體。

3 靈芝孢子粉藥理活性

靈芝孢子粉有效活性物質含量豐富,不同的活性物質成分具有不同的功能效果,主要為抗氧化、免疫調節、抗癌防癌、保護神經、保肝護肝、調節血脂血糖等。靈芝孢子粉中三萜類物質和多糖類物質含量較高,其藥理活性相較于其他活性物質具有更高且多樣化的藥理活性,是當前研究的熱點。

3.1 抗氧化作用

靈芝孢子粉的抗氧化作用較佳,主要與多糖類物質有關,作用效果與多糖的單糖組成、結構和分子量大小有很大的關系。Heleno等[5]考察了靈芝子實體、孢子粉和菌絲體三個部位多糖提取物的抗氧化活性,研究表明,靈芝孢子粉多糖相較于其他兩個部位的抗氧化活性最好。劉宇琪等[38]對靈芝孢子粉粗多糖進行了分離提純,洗脫得到兩種靈芝孢子粉多糖,考察了其ABTS自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力和還原能力,結果表明,靈芝孢子粉純化多糖具有較高的抗氧化活性。Liu等[39]研究了破壁靈芝孢子粉對肉雞生長表現、氧化應激和免疫力的影響,結果表明,飼喂破壁靈芝孢子粉的肉雞的總抗氧化能力、谷胱甘肽還原酶和過氧化氫酶的活性以及肝臟和脾臟中還原型谷胱甘肽的濃度顯著高于對照組肉雞。

3.2 免疫調節作用

免疫調節作用是靈芝孢子粉的一個重要藥理作用,在傳統中藥中已有較長的應用歷史,靈芝孢子多糖、三萜化合物和靈芝孢子蛋白質通過不同的作用機制增強機體的特異性免疫和非特異性免疫功能。王瑛等[40]進行了破壁靈芝孢子粉對于增強小鼠免疫功能的實驗,其結果顯示在細胞免疫功能方面,靈芝孢子粉能夠提高Con A誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化能力,在體液免疫方面可以增加抗體生成細胞數,在單核-巨噬細胞功能方面可以增加小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的能力,表明靈芝孢子可以通過增強免疫細胞的活性,從而直接或間接調節機體免疫功能。Habijanic等[41]研究表明靈芝孢子粉通過提高巨噬細胞產生腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素(IL)和促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的水平來達到調節免疫的作用。

3.3 抗腫瘤作用

靈芝孢子粉的抗腫瘤作用主要由多糖類、三萜類和甾醇類化合物等為主的有效成分起到關鍵性的作用。靈芝三萜類化合物具有光譜抗腫瘤特性,目前主要體現在對癌細胞的抗轉移、抗增殖和抗血管生成活性能力等幾個方面,閆征等[4]研究了三種三萜化合物(Ganoderenic acid Y、7-oxo-ganoderic acid Z2和Ganoderon B)與五種腫瘤細胞的量效關系,其研究結果表明Ganoderenic acid Y 的抑制作用較強,癌細胞H460的IC50為22.4 μmol/L,其次是7-oxo-ganoderic acid Z2,其IC50為43.1 μmol/L。彭學翰等[42]研究了靈芝孢子油對人肝癌細胞(HepG2)、人非小細胞型肺癌細胞(A549)、人結腸癌細胞(HCT116)三種細胞株的抗腫瘤活性,經MTT細胞活力實驗驗證,顯示靈芝孢子油對3種腫瘤細胞的生長均具有一定抑制作用,其抑制強度依次為A549細胞、HepG2細胞、HCT116細胞。Zhang等[43]研究了靈芝孢子葡聚糖(GLIS)的免疫活化能力和抗腫瘤作用,其研究發現使用GLIS處理小鼠脾源性肉瘤細胞S180后,小鼠B淋巴細胞能產生大量免疫球蛋白,并促使巨噬細胞分泌大量免疫活性物質如IL-1β和活性氮中間體等,明顯提高了巨噬細胞介導的腫瘤細胞毒作用,對腫瘤的生長抑制率達到了60%。除此以外,相關研究還指出靈芝孢子的提取物對肝癌[44]、膽管癌[45-46]、前列腺癌[47]都具有較好的治療效果。

表1 靈芝孢子粉抗腫瘤作用機制探討Table 1 Study on anti-tumor mechanism of G. lucidum spores

3.4 保肝作用

有關研究表明,靈芝孢子粉對于肝纖維化、肝損傷、肝炎等常見的幾種疾病具有不同程度的作用與效果,保肝、護肝效果明顯。Jin等[48]研究了靈芝孢子粉對鎘Cd-II 誘導引起的肝毒性損傷的影響和保護機制,證明靈芝孢子對肝損傷小鼠具有保護作用,其主要作用方式是減少血清中ALT、AST含量和MDA含量,改善了組織的病理狀態,從而達到保肝作用。胡宗苗等[49]研究了靈芝孢子對CCl4引起的肝纖維化小鼠保護作用,結果顯示經靈芝孢子處理的小鼠血清中ALT和AST含量顯著降低,肝組織中SOD含量升高,MDA含量降低,同時使得肝纖維化程度降低,抑制了肝組織中MMP-9的蛋白表達,表明靈芝孢子粉對CCl4引起的小鼠肝纖維化損傷有一定保護作用,可能是通過調節MMP-9蛋白表達來實現。

3.5 其他功效作用

靈芝孢子粉具有優良的抗衰老作用,關萍[50]通過構建纖毛蟲細胞衰老模型研究了靈芝孢子粉的抗細胞衰老效應,結果顯示靈芝孢子粉對細胞增值率、生長周期及RCC-1基因mRNA表達量等多項指標產生的作用效果較顯著,加強了模型細胞的生理活性,表現出顯著的抗衰老效果。靈芝孢子粉具有抗糖尿作用,姜余梅等[51]通過鏈脲佐菌素誘導建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型,考察了靈芝孢子和抗性淀粉對糖尿病大鼠的血糖、血脂及氧化應激指標的影響,結果顯示抗性淀粉和靈芝孢子協同干預可改善糖尿病大鼠血糖水平,對抗糖尿病引起的氧化應激損傷。靈芝孢子粉具有保護神經的作用,Zhou等[52]預先對大鼠進行了不同劑量的飼喂處理,結果顯示,服用較高劑量的靈芝孢子粉的大鼠在ICV STZ損傷后,其體內海馬區谷胱甘肽/谷胱甘肽過氧酶(GSH/GR)和丙二醛(MDA)含量能夠恢復到常規水平,保護了大鼠的海馬區神經細胞,這為預防和治療阿爾茨海默病提供了良好的依據。Zhu等[53]通過響應面法從靈芝孢子粉中優化提取了一種新的蛋白多糖,并對其藥理作用進行了初步的研究,結果表明,蛋白多糖具有較好的降血糖、抗菌和抗腫瘤效果,具有良好的應用潛力。姚金福等[54]研究了靈芝孢子粉對脂多糖(LPS)誘導細胞損傷的保護作用及機制,發現經過給予靈芝孢子粉處理,人氣道上皮細胞的活力明顯提高,細胞上清液中MDA、TNF-α、IL-6顯著降低,SOD的含量顯著提高,同時細胞內NF-κB蛋白表達顯著降低,表明靈芝孢子粉對LPS誘導的人氣道上皮細胞損傷有保護作用。

4 靈芝孢子粉作用機理

近年來,有關靈芝孢子粉或對其中的功能性成分作用的體外評價和動物實驗不斷被報道,對其功能性作用機制的研究也逐漸深入,更好地解釋相關活性成分的藥理作用,也為靈芝孢子粉新藥的研發提供重要的指導。靈芝孢子粉的抗腫瘤作用是當前國內外學者的研究熱點,對不同腫瘤細胞的作用機制開展了很多的研究,表1歸納整理了靈芝孢子粉的部分抗腫瘤機制研究。

5 靈芝孢子粉開發現狀

靈芝及靈芝孢子粉是國內外眾多科研院校、研究所和企業單位研究學者的研究熱點,促進了靈芝及靈芝孢子粉的應用發展,目前靈芝類的國產藥品有178種,靈芝孢子粉類的國產藥品僅有4種;靈芝類的保健食品高達1100多種,靈芝孢子類的國產保健食品有400多種(國家市場監督管理總局網站)。在眾多的靈芝相關精加工產品中,靈芝保健品種類數量最多[61],由于靈芝孢子粉和靈芝都不屬于藥食同源的食物,不能作為普通食品添加在食品中,只能夠作為藥品和保健食品原料進行開發和利用。

5.1 開發應用現狀

由于藥品的準入門檻較高,研發生產成本較高,目前靈芝孢子粉用于保健品的加工生產是主流。陳祖琴等[62]研究了靈芝保健食品的現狀規模,其數據表明單方靈芝保健食品占比超過80%以上,其中以孢子粉為原料的靈芝類保健品占單方靈芝保健食品的40%;復方靈芝保健品主要以靈芝不同原料與其他中藥材混合的產品,靈芝原料以靈芝提取物和孢子粉較為常見。用作靈芝類保健品的孢子粉大多通過人工栽培的方式獲得,主要原因是由于人工栽培的靈芝相比于野生靈芝生長周期短,得率高,成本低,能夠滿足工業化生產的需求[63]。此外,破壁靈芝孢子粉的有效活性成分在人體消化環境內被吸收利用的比例高[64-65],故目前靈芝類保健品多以破壁靈芝孢子粉為原料,近年來隨著栽培技術、采集技術的發展以及種植規模的擴大,孢子粉的產量不斷增加,靈芝孢子粉在保健品中的應用已經超過了靈芝子實體[20]。

5.2 功能作用現狀

目前已備案的靈芝孢子保健品的保健功能有11種,分別為增強免疫力、保肝護肝、緩解疲勞、改善睡眠、降血糖、降血脂、抗輻射、增強缺氧耐受能力、抗氧化、減肥、改善記憶,多數保健品為單一保健功能,以增強免疫力這一保健功能占大部分,其主要原因在于一方面靈芝孢子粉具有增強免疫力這一藥理活性已被大量研究報道[6,66-67],另一方面靈芝孢子保健品申報增強免疫力這一保健功能無需進行人體實驗,相對成本較低、周期短。

5.3 其他功能與應用

目前對于靈芝孢子粉的研究也出現了一些非生物學和藥理學的研究,為靈芝孢子粉的多元化利用提供了新的思路。Zhou等[68]研究了一種通過噴霧干燥微膠囊保護靈芝孢子油的方法,選用阿拉伯膠和麥芽糖糊精作為壁材是一種最佳的組合,可顯著提高靈芝孢子油的氧化穩定性。Zhu等[69]通過雙頻超聲輻射技術成功將靈芝孢子粉的幾丁質轉化為殼多糖,其制備的樣品對L929細胞的增殖具有一定的影響,同時對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑制作用。Fan等[70]利用靈芝孢子粉制取了一種新型磁性孢子微球,作為固定CotA多銅氧化酶的支撐材料,對其負載能力展開了研究,結果顯示裝載有CotA的磁性微球可以通過外部磁場容易且快速地回收,活性高,且連續10次循環后保持75%的活性,表明磁性孢子微球是用于固定酶的良好支撐材料。

6 結論與展望

靈芝孢子粉及其相關產品因其優良的生物學活性及其廣泛的藥理作用越來越受到消費者的青睞。近年來,國內外學者已對靈芝孢子粉進行了廣泛的藥理作用和保健功能的研究,對部分活性成分進行了提取分離、純化和結構鑒定,不斷有新的藥理活性被報道,在新藥開發、治療佐劑、保健食品等方面展現出巨大的開發前景。但受到靈芝孢子粉內活性成分組成的復雜性和分離分析方法的制約,相關活性成分的分子結構、作用途徑、細胞水平和分子水平的作用機制的明確報道很少,臨床研究也相對缺乏,這將成為今后研究工作的重點。此外,當前對于去壁靈芝孢子粉副產物(主要成分為靈芝孢子壁)已見一些研究報道,合理利用去壁靈芝孢子粉副產物對于提高綜合經濟效益及減少廢棄物的生成進而降低廢渣處理成本和對環境的污染具有重要的研究意義。

隨著靈芝種植規模的擴大,栽培技術和靈芝孢子收集技術的發展,破壁方法及分離技術的進步,對靈芝孢子粉的研究將會不斷深入,靈芝孢子粉更多的藥理作用將會不斷被發掘和證實,有望開發出新型藥品和新型保健品,為消費者提供更多且更有針對性的選擇,推動靈芝孢子粉精深加工產品國際化進程。