基于HPLC-ELSD對浙貝母功效成分地理變異的研究

張曉芹 呂虹艷 藍艷 陳禮平

[摘要] 目的 探討浙貝母的功效成分地理變異情況及其形成的原因。 方法 采用Kromasil ODS C18色譜柱（200 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.03%二乙胺水，流速為1 mL/min，柱溫40℃;運用SPSS 20.0軟件進行數據分析。結果 麗水市云和縣龍埠村（LS-YH-LB）貝母素甲、乙的總含量最高;14個產區的貝母素甲含量高于貝母素乙，5個產區貝母素乙含量高于貝母素甲;聚類分析中，LS-YH-LB、溫州市樂清市盛家塘村等8個高含量產區聚為一類，其他產區聚為一類。 結論 浙貝母中功效成分存在明顯的地理變異現象，暗示不同產區浙貝母存在一定的質量差異。本研究為浙貝母規范化化種植及進一步開發利用提供參考依據。

[關鍵詞] 浙貝母;功效成分;形成原因;道地產區

[中圖分類號] R284.1????????? [文獻標識碼] A????????? [文章編號] 1673-7210（2020）01（c）-0110-05

Quantification of chemical compositions in Fritillaria thunbergii from different geographical origin by HPLC-ELSD

ZHANG Xiaoqin?? LYU Hongyan?? LAN Yan?? CHEN Liping

Department of Pharmaceutical， Lishui Hospital of Traditional Chinese Medicine， Zhejiang Province， Lishui?? 323000， China

[Abstract] Objective To investigate the contents of the functional components in Fritillaria thunbergii from different geographical locations. Methods Kromasil ODS C18 column （200 mm × 4.6 mm， 5 μm） column was used as the column， acetonitrile-0.03% diethylamine was used as the mobile phase， the flow rate of 1.0 mL/min. The colomn temperature maintained at 40℃. Multivariate statistical analysis was carried out by SPSS 20.0. Results The total contents of verticine and verticinone were the highest in Longbu village， Yunhe county， Lishui city （LS-YH-LB）. The content of verticine was higher than that of verticinone in 14 producing areas， and the verticinone was higher than that of verticine in 5 producing areas. In the cluster analysis， eight high-content producing areas， such as LS-YH-LB and Leqing city， Wenzhou city， were grouped into one category， while other producing areas were grouped into one category. Conclusion There are obvious geographical variations in the functional components of Fritillaria thunbergii， which indicats that there are some quality differences in different producing areas of Fritillaria thunbergii. This study provides reference for the standardized planting and further development and utilization of Fritillaria thunbergii.

[Key words] Fritillaria thunbergii; Chemical compositions; Cause of formation; Genuine producing area

[基金項目] 浙江省衛生計生委中醫藥科技計劃項目（2015Z A229）;浙江省麗水市重點科技創新團隊建設項目（2018cxt d06）;浙江省基礎公益研究計劃項目（LGF19H280002）。

浙貝母為百合科（Liliaceae）植物浙貝母（Fritillaria thunbergii）的干燥鱗莖，具有化痰止咳、清熱散結之功效，生物堿為其化痰、止咳的主要成分[1-2]。不同產區浙貝母中總生物堿含量和指紋圖譜均存在一定的差異[3-7]。針對貝母素甲、貝母素乙的含量而言，是否存在明顯的地理變異規律及其形成的原因很少有人研究。闡明浙貝母功效成分的地理變異規律，對于指導高質量浙貝母的規范化種植、提高浙貝母臨床療效穩定性具有重要的意義。

本研究在前人研究基礎上[8-9]建立了浙貝母中貝母素甲、乙的HPLC-ELSD的含量測定方法，并對27個產地的浙貝母樣品進行含量測定，分析浙貝母功效成分地理變異的規律性，探討了浙貝母傳統道地產區藥材質量與現代種植產區藥材質量的差異，為浙貝母規范化種植及臨床應用提供參考依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），Altech ELSD 2000檢測器，XS105DU電子天平（萬分之一，瑞士梅特勒公司），KQ5200D超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），FW100型高速萬能粉碎機（上海隆拓儀器設備有限公司）。

1.2 試劑

甲醇（分析純，杭州高晶精細化工有限公司）;乙腈（色譜純，Spectrum Chemical Mfg.Corp.）;氯仿（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）;貝母素甲標準品（批號：110750-201612，中國食品藥品檢定研究院）;貝母素乙標準品（批號：110751-201611，中國食品藥品檢定研究院）。

1.3 實驗樣品

樣品信息見表1，由麗水市中醫院林娜副主任中藥師鑒定為百合科植物浙貝母（Fritillaria thunbergii）。

表1?? 樣品采集信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Kromasil ODS C18色譜柱（200 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為A乙腈，B 0.03 % 二乙胺水（65∶35），流速1 mL/min，漂移管溫度85℃，氮氣壓力0.4 mPa，增益50，載氣流速2.2 L/min，柱溫40℃。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱定貝母素甲、乙對照品各2、1.5 mg，加甲醇溶解，制成每1 mL含貝母素甲0.2 mg、貝母素乙0.15 mg的混合溶液。

2.3供試品溶液的制備

精密稱定粉末2 g，置50 mL具塞三角瓶中，加濃氨試液4 mL浸潤15 min，精密加入三氯甲烷-甲醇4∶1的混合溶液40 mL，稱定重量，混勻，超聲（300 W，40 kHz）提取1 h，放冷，再稱定重量，加上述混合溶液補足減失的重量，濾過。精密量取續濾液5 mL，置蒸發皿中蒸干，殘渣加甲醇使溶解并轉移至5 mL定量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜過濾備用。

2.4線性關系的考察

取配好的標準品溶液，依次進樣1、2、5、10、15、20 μL。以lgA為縱坐標，lgC為橫坐標采用雙對數線性回歸處理方法得到貝母素甲的線性回歸方程Y = 1.4260X+3.6371（r = 0.9998），線性范圍為0.2～4.0 μg;貝母素乙的線性回歸方程Y = 1.49X+ 3.50（r = 0.9996），線性范圍為0.15～3.0 μg。

2.5 精密度試驗

取對照品溶液，重復進樣5次，每次10 μL，貝母素甲、乙峰面積積分值的RSD分別為1.08%、1.19%。

2.6 重復性試驗

精密稱取同一批浙貝母樣品5份，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣10 μL。貝母甲、乙峰面積積分值的RSD分別為2.06%、1.58%。

2.7 穩定性試驗

精密稱取同一份樣品，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別在1、3、5、7、9、12 h進樣10 μL。貝母素甲、乙峰面積積分值的RSD分別為2.33%、2.55%。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱定已知含量的樣品3 g共6份，加入內含貝母素甲2 mg/mL、貝母素乙1.5 mg/mL的對照品溶液，使加入對照品的量與樣品中貝母素甲、乙的含量相當，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣10 μL。貝母素甲、乙的平均回收率分別為96.99%、96.81%，RSD分別為2.23%、2.37%。見表2。

2.9 含量測定結果

除了磐安縣大處村（PA-DC）外，余下產地的貝母素甲、乙的總量均達到藥典要求，栽培浙貝母的質量控制環節較為成熟。見表3。

2.10 貝母素甲、乙及總量的產地差異分析

不同產區貝母素甲、乙及二者總量存在明顯差異。麗水市云和縣龍埠村（LS-YH- LB）貝母素甲、乙的總含量最高，其次為溫州市樂清盛家塘村（WZ-LQ-SJT）村，再次為麗水市縉云縣外麻車村（LS-JY-WMC），磐安縣大處村（PA-DC）貝母素甲、乙的總量最低，其次為寧波樟水（NB-ZS）產地。見圖1。

2.11 貝母素甲、乙的含量比例差異分析

不同產區二者占總含量的比例并不是均勻分布的，14個產區的貝母素甲含量高于貝母素乙（LS-YH-LB、PA-DK、PA-DC、JS-NT、NS-ZS等），5個產區貝母素乙含量高于貝母素甲（LS-JY-QM、LS-JY-QC、NB-ZX等），還有8個產區二者含量相差不大（PA-ZT、PA-PT、WZ-YQ-SJT、NB-HX等）。貝母素甲含量最高為寧波章水鎮（NB-ZS），其次為磐安縣大處村（PA-DC），貝母素乙含量最高為縉云縣潛陳村（LS-JY-QC），其次為縉云縣古溪村（LS-JY-GX）和寧波樟溪村（NB-ZX）。見圖2。

2.12 貝母素甲、乙及總量的聚類分析

運用SPSS 20.0軟件進行聚類分析。27個產地共聚為兩大類，第一大類為高含量組，包括LS-YH-LB、WZ-YQ-SJT、LS-JY-WMC、PA-ZT、LS-QY-YX、PA-DK、YK-BY、JS-NT 8個產區，貝母素甲乙的總含量大于0.15%，余下的19個產區聚為第二大類。聚類圖中所有產地分散于不同的聚類分支中，并沒有同一或相近產區聚為一類的現象，不同產區浙貝母中貝母素甲、乙及二者總含量沒有根據產區呈現出明顯的規律性。見圖3。

3 討論

3.1 浙貝母中功效成分地理變異形成原因的探討

不同產區浙貝母中化學成分的含量差異較大，總含量最大值與最小值之間相差可達3.3倍，貝母素甲占總量的比例最大值與最小值之間相差可達1.5倍，貝母素乙占總量的比例最大值與最小值之間相差可達1.7倍。提示浙貝母存在顯著的功效成分地理變異現象。導致植物地理變異的原因可分為環境、遺傳、人為三大因素，其中環境和人為因素導致直接性的成分變化、遺傳導致成分變化可被“烙印”而世代相傳[10-12]。本研究中，浙貝母中有效成分并沒有根據地理區域的位置而形成相應的聚類，所有產區散在分布在不同的聚類分支中，提示產區外在環境沒有對浙貝母中化學成分的變化造成顯著影響。由于浙貝母現基本為栽培[13]，種源混雜，還需要結合種源基因進一步研究方能徹底解析浙貝母功效成分地理變異形成的原因[14]。

3.2非道地產區浙貝母質量的分析

浙貝母主要分布于江蘇南部、浙江北部和湖南等地，浙江省寧波市象山為浙貝母的道地產區[15]。近年來，金華市磐安縣開始大規模引種栽培浙貝母，建立浙貝母規范化生產基地[16]，其產出已經有超越寧波產浙貝母之勢。根據本研究結果，寧波產浙貝母和磐安縣浙貝母中有效成分的含量并沒有達到最高，反而麗水市云和縣產浙貝母質量最優，聚類分析表明，浙貝母中有效成分不以產區為聚類傾向，說明在其他產區進行浙貝母栽培具有可行性。

3.3 浙貝母功效成分地理變異研究中存在的問題

本研究發現浙貝母功效成分存在顯著的地理變異現象，這種地理變異沒有呈現明顯的地理區域規律，但在本研究所采集的樣品中，明確了浙貝母質量最優產區，初步闡明了可能導致這種現象的原因。遺憾的是本研究所采集產區及樣品數量有限，若想徹底解析浙貝母功效成分地理變異格局及規律，仍需擴大采樣地點，加大樣本量，浙貝母功能基因研究或許是揭開其地理變異遺傳機制的一個新途徑，目前已有學者針對其生物堿含量與功能基因表達的關系進行了研究[17-18]。另一方面，本研究對于采集地的土壤因子、氣候因子、種植技術等信息還未能全面掌握，環境和種源依然是其功效成分地理變異的主要外在因素[19-20]。對浙貝母功效成分地理變異進行分析及探討，仍需以此為基礎開展進一步研究。

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（收稿日期：2019-08-20? 本文編輯：劉永巧）

[作者簡介] 張曉芹（1988.11-），女，碩士;研究方向：藥用植物與分子生藥學。

[通訊作者] 陳禮平（1968.1-），男，主任醫師，碩士;研究方向：民族醫學、中藥鑒定與中藥質量分析。