慢性乙型肝炎患者外周血T 淋巴細胞程序性死亡受體1表達與HBV-DNA 水平的相關性

謝 巍，趙 川，王 容，王文平，涂 宏

（1）四川省遂寧市中心醫院消化內科；2）心血管三病區，四川遂寧 629000）

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）為臨床常見肝臟疾病，由乙型肝炎病毒（HBV）持續感染引起，調查顯示，我國CHB 患者人數為3 000萬左右[1]。研究認為，HBV 持續感染的原因與患者T 淋巴細胞功能低下有關[2]。相關資料指出，T 淋巴細胞數量和質量上的缺陷會使HBV 難以有效清除，繼而導致疾病慢性化[3]。程序性死亡受體1（PD-1）是近年來發現的一種分子量為55KD 的單體I 型跨膜蛋白，為CD28 分子家族成員，可與程序性死亡配體1（PDL-1）結合，阻斷CD28 分子介導激活磷酸肌醇3 激酶途徑，繼而抑制T 淋巴細胞增殖與分化，減弱T 淋巴細胞功能[4-5]。隨著對細胞免疫學的深入研究，部分學者認為CHB 的發生與發展可能與PD-1 有關[6]。本次研究以遂寧市中心醫院92 例CHB 患者為研究對象，分析CHB 患者外周血T 淋巴細胞PD-1 水平，并探討其與HBV-DNA 的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取遂寧市中心醫院2016 年1 月至2019 年3月收治的92 例CHB 患者為研究對象，均符合中華醫學會感染病學分會頒布的《慢性乙型肝炎防治指南》（2015 版）[7]中CHB 診斷標準，排除合并其他類型肝炎病毒感染、自身免疫性肝病、酗酒史、血液系統疾病和人類免疫缺陷病毒（HIV）感染者，且本次研究前6 個月未進行過抗病毒和免疫治療，所有患者均自愿參與本次研究。92 例CHB 患者中男55 例，女37 例；年齡25～70 歲，平均（45.69±10.73）歲。另選擇60 例健康志愿者作為對照組，其中男36 例，女24 例；年齡22～64歲，平均（43.75±9.18）歲。

1.2 方法

外周血T 淋巴細胞PD-1 檢測：取兩組受檢者新鮮EDTA 抗凝全血，加入CD4-FTTC 或CD8-FTTC、PD-1-PE 或其相應同型對照抗體（均由美國eBioscience 公司提供），于4℃環境中避光孵育20 min，之后加入500 μL 紅細胞裂解液（由美國BD 公司提供），再于4℃環境中避光孵育10 min，加入1 000 μL磷酸鹽緩沖溶液，以500×g 的轉速離心5 min，洗滌后使用流式細胞儀（由美國BD 公司提供）檢測。

HBV-DNA 水平檢測：采用熒光定量PCR 檢測，試劑盒由上海申友生物技術有限公司提供，PCR 儀由美國Applied Biosystems 公司提供，型號為ABI PRISM 7500 型。抽取患者外周靜脈血3 mL，以4 000 r/min 的速度離心5 min，置于-80℃環境中冷凍備用。取PCR 反應管，將實驗試劑與HBV 定量檢測試劑盒試劑置于室溫下解凍，之后將其混勻。取50 μL血漿標本，加入等量DNA 提取液，混勻，將混合液置于100℃環境中靜置10 min，再在4℃環境中靜置10 h，待混合液完全裂解，以13 000 r/min 的速度離心5 min，吸取2 μL上清液，加入至PCR 反應管，以6 000 r/min的速度離心30 s，取上清液置入PCR 基因擴增儀，93℃環境中預變性2 min，30 s 變性，55℃1 min退火，反復40 次，擴增儀擴增后進行結果宣讀。所有操作過程均嚴格按照說明書進行，檢測下限為1×103IU/mL。

1.3 統計學處理

2 結果

觀察組和對照組外周血CD4+、CD8+T 淋巴細胞PD-1 表達情況比較觀察組外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞PD-1 表達水平高于對照組（P＜0.05），見表1。

不同HBV-DNA 水平的CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴細胞PD-1 表達情況比較92 例CHB 患者平均HBV-DNA 水平為（5.25±1.68）IgIU/mL，其中HBV-DNA 高水平組（＞6 IgIU/mL）34 例，HBV-DNA 中水平組（3～6 IgIU/mL）38例，HBV-DNA 低水平組（＜3 IgIU/mL）20 例。不同HBV-DNA 水平的CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴細胞PD-1 表達水平均存在差異（P＜0.05），其中HBV-DNA 高水平組外周血CD4+、CD8+T 淋巴細胞PD-1 表達水平高于HBV-DNA 中水平組和HBV-DNA 低水平組，HBV-DNA 中水平組外周血CD4+、CD8+T 淋巴細胞PD-1 表達水平高于HBV-DNA 低水平組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2。

CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴細胞PD-1表達水平與HBV-DNA 水平的相關性分析CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴細胞PD-1 表達水平與HBV-DNA 水平均呈正相關（P＜0.05），見表3、圖1～2。

表1 觀察組和對照組外周血CD4+、CD8+T 淋巴細胞PD-1 表達情況比較（）Tab.1 Expressions of PD-1 in peripheral blood CD4+and CD8+T lymphocytes in the observation group and the control group（）

表1 觀察組和對照組外周血CD4+、CD8+T 淋巴細胞PD-1 表達情況比較（）Tab.1 Expressions of PD-1 in peripheral blood CD4+and CD8+T lymphocytes in the observation group and the control group（）

表2 不同HBV-DNA 水平的CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴細胞PD-1 表達情況比較（）Tab.2 Expressions of PD-1 in peripheral blood CD4+and CD8+T lymphocytes in CHB patients with different HBV-DNA levels（）

表2 不同HBV-DNA 水平的CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴細胞PD-1 表達情況比較（）Tab.2 Expressions of PD-1 in peripheral blood CD4+and CD8+T lymphocytes in CHB patients with different HBV-DNA levels（）

與HBV-DNA 低水平組比較，*P ＜0.05；與HBV-DNA 中水平組比較，#P ＜0.05。

表3 CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴細胞PD-1 表達水平與HBV-DNA 水平的相關性分析Tab.3 The correlation between the expression levels of PD-1 in peripheral blood CD4+and CD8+T lymphocytes and HBV-DNA levels in patients with CHB

圖1 CHB 患者外周血CD4+T 淋巴細胞PD-1 表達水平與HBV-DNA 水平散點圖Fig.1 Scatter plot showing the expression level of PD-1 in peripheral blood CD4+ T lymphocytes and HBV-DNA level in patients with CHB

圖2 CHB 患者外周血CD8+T 淋巴細胞PD-1 表達水平與HBV-DNA 水平散點圖Fig.2 Scatter plot showing the expression level of PD-1 in peripheral blood CD8+ T lymphocytes and HBV-DNA level in patients with CHB

3 討論

HBV 為雙鏈DNA 病毒，其入侵人體后會受到宿主免疫系統防御作用，HBV 特異性T 淋巴細胞會殺滅受感染細胞，繼而抑制HBV-DNA 復制[8]。但由于個體對病毒免疫應答存在差異，故而形成HBV 感染不同轉歸。CHB 是HBV 持續感染導致，其發生原因與機體免疫功能異常有關，T 淋巴細胞免疫功能狀態對HBV 清除程度起到重要作用。

PD-1 是在程序性死亡的T 淋巴細胞上發現的一種跨膜蛋白，可在活化的CD4+、CD8+T 淋巴細胞上進行誘導性表達。相關研究表示，PD-1 可抑制T 淋巴細胞，并誘導免疫耐受，當其與PDL-1結合后，會增強T 淋巴細胞線粒體內氧化反應，使得活性氧和過氧化氫水平升高，繼而抑制T 淋巴細胞增殖，誘導其凋亡，削弱機體對病毒的免疫應答，誘導免疫逃逸[9-10]。眾多研究顯示，在HIV、丙型肝炎病毒（HCV）等病毒慢性感染患者中，其PD-1 表達均明顯升高，而這與T 淋巴細胞功能受限相關[11-12]。肖健等[13]研究表明，HIV-1 感染患者外周血CD8+T 淋巴細胞PD-1 表達明顯高于健康人群，其認為PD-1 高度表達與HIV 感染患者CD8+T細胞功能受到抑制和免疫耗竭有關。本次研究分析CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴細胞PD-1 表達情況，顯示觀察組外周血CD4+、CD8+T 淋巴細胞PD-1 表達水平高于對照組（P＜0.05），表明CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴細胞PD-1 表達增加。申紅玉等[14]研究也表明，慢性HBV 感染患者CD4+、CD8+T 淋巴細胞PD-1 表達水平過高。

分析不同HBV-DNA 水平的CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴細胞PD-1 表達水平，顯示HBV-DNA 高水平組外周血CD4+、CD8+T 淋巴細胞PD-1 表達水平＞HBV-DNA 中水平組＞HBV-DNA低水平組（P＜0.05），提示CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴細胞PD-1 表 達 水 平 與HBV-DNA 水平存在一定關聯性。進一步行Pearson 相關性分析，發現CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴細胞PD-1 表達水平與HBV-DNA 水平均呈正相關（r=0.527，r=0.568，P＜0.05）。分析原因，T 淋巴細胞增殖和分化受到PD-1/PDL-1通路的影響，水平下降，機體免疫防御機制越差，有利于HBV 復制，HBV-DNA 水平升高，且PD-1水平越高，T 淋巴細胞功能受限越嚴重，HBV 復制能力越強，HBV-DNA 水平越高。李志勤等[15]研究指出，對CHB 患者采用抗病毒治療，其治療后外周血CD8+T 淋巴細胞PD-1 表達水平明顯下降，這也為本次研究結果提供佐證。

實驗證實，對HBV 感染小鼠予以PD-1 抗體或PDL-1 抗體來阻斷PD-1/PDL-1 通路，可增強抗病毒免疫作用[16-17]。相關研究表明，阻斷PD-1/PDL-1 通路可以促進HIV-1 感染患者CD8+T淋巴細胞腫瘤壞死因子（TNF-α）和干擾素γ（INF-γ）分泌，而TNF-α 可促使被感染細胞凋亡，INF-γ 可進行免疫調節，認為PD-1 參與了CD8＋T 淋巴細胞功能抑制[13，18]。基于兩種感染疾病PD-1 表達均過高，推測可通過阻斷PD-1/PDL-1通路來增強機體免疫功能，但由于本次研究條件有限，未能對此進行探討，可將此點作為后期研究內容[19-20]。

綜上所述，CHB 患者外周血CD4＋、CD8＋T 淋巴細胞PD-1 表達增加，且會隨著HBV-DNA 水平的升高而升高。CHB 患者外周血CD4+、CD8+T 淋巴細胞PD-1 的過表達與T 淋巴細胞功能受限有關，可考慮阻斷PD-1/PDL-1 通路來恢復CD4+、CD8+T 淋巴細胞功能。