響應(yīng)面法優(yōu)化莜麥蛋白微波輔助堿法提取工藝

寧芯 ，班薇薇，王國澤，莫紫梅，汪磊 *

1. 玉林師范學(xué)院化學(xué)與食品科學(xué)學(xué)院（玉林 537000）；2. 廣西農(nóng)產(chǎn)資源化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（玉林 537000）；3. 內(nèi)蒙古科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（包頭 014010）；4. 廣西-東盟食品藥品安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心（南寧 530001）

莜麥又稱裸燕麥，起源于我國，在我國高寒地區(qū)糧食生產(chǎn)中占有重要的地位[1]。莜麥?zhǔn)鞘澜绻J(rèn)營養(yǎng)價(jià)值很高的糧種之一[2-3]，頗具保健療效[4-6]。隨著人們生活水平的提高和對(duì)營養(yǎng)概念的不斷認(rèn)識(shí)，莜麥制品正日益受到人們的青睞，已被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥、化妝品和工業(yè)原料等領(lǐng)域[7-9]。莜麥中蛋白質(zhì)高達(dá)11.4%～19.9%，居禾谷類作物之首[1,10-11]。莜麥蛋白質(zhì)是谷物中氨基酸組成最平衡的蛋白質(zhì)之一，其氨基酸含量多且種類齊全，配比合理，人體利用率高，其中人體的8種必需氨基酸是小麥的2倍多，且含有較多兒童發(fā)育不可缺少的組氨酸和賴氨酸[12]。經(jīng)常攝入莜麥?zhǔn)称罚梢杂行Ц纳莆覈鴤鹘y(tǒng)膳食引起的賴氨酸缺乏癥。因此，莜麥蛋白是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源，具有良好的開發(fā)前景。

傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)提取主要采用堿法提取，該方法雖然比較成熟，但需耗費(fèi)大量堿液，所得的蛋白質(zhì)純度不高，且提取率低，提取時(shí)間長，易造成蛋白質(zhì)的水解和結(jié)構(gòu)破壞[13-14]。微波輻射輔助提取法利用微波強(qiáng)化固液浸取過程，具有選擇性高、提取時(shí)間短、提取得率高以及不需要特殊的分離步驟等優(yōu)點(diǎn)，是一種頗具發(fā)展?jié)摿Φ奶崛〖夹g(shù)[15]，近年來微波輔助提取法已被廣泛應(yīng)用于多糖[16]、多酚[17]和蛋白[18-19]等成分的提取。

當(dāng)前，常規(guī)堿法提取莜麥蛋白的研究較少，且采用微波輔助堿法提取莜麥蛋白的研究還鮮見報(bào)道。試驗(yàn)研究莜麥蛋白的微波輔助減法提取工藝，在單因素基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化莜麥蛋白的提取工藝，以期為莜麥蛋白的提取和莜麥資源的加工利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、設(shè)備與儀器

莜麥（蒙燕7413），產(chǎn)于內(nèi)蒙古武川縣。

石油醚（分析純，天津永大化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（分析純，天津市華東試劑廠）；鹽酸（分析純，天津市振興化工試劑廠）；無水乙醇（分析純，天津市永天化學(xué)試劑有限公司）；牛血清蛋白（北京拜爾迪生物公司）；考馬斯亮藍(lán)（分析純，北京化學(xué)試劑公司）。

DFT-200 200克手提式高速萬能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；JA5003電子分析天平（上海越平科技儀器有限公司）；L-550臺(tái)式低速大容量離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；PHS-3B型雷磁pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；WLS-l型微波爐（南京三樂微波研究所）；UV-7504單光束紫外-可見分光光度計(jì)（上海欣茂儀器有限公司）；KDN-08A定氮儀（上海昕瑞儀器儀表有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 莜麥蛋白的提取工藝

莜麥蛋白微波輔助堿提法：莜麥籽粒→磨粉→過篩→石油醚脫脂→脫脂莜麥粉→調(diào)漿→調(diào)pH→微波萃取→過濾→提取液→含量測(cè)定。

精確稱取5 g脫脂莜麥粉于三角瓶中，按一定料液比加入蒸餾水，并用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH，在一定功率的微波下浸提一定時(shí)間，以3 500 r/min離心15 min，分離上清液，通過考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)含量，計(jì)算微波輔助堿法提取莜麥蛋白提取率。

1.2.2 莜麥蛋白提取率的計(jì)算

采用凱氏定氮法測(cè)定脫脂莜麥粉中總蛋白的含量，通過考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定提取液中蛋白質(zhì)含量[20]。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)處理

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel軟件、SPSS軟件和Design-Expert軟件進(jìn)行處理和分析。其中，顯著性分析采用Duncan檢驗(yàn)，p＞0.05判定為變化不顯著，p＜0.05判定為變化顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

以莜麥蛋白提取率為指標(biāo)，分別研究微波功率（140，280，420，560和700 W）、pH（8，8.5，9，9.5，10和10.5）、料液比（1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25（g/mL））、提取時(shí)間（0.5，1，1.5，2和2.5 h）對(duì)莜麥蛋白提取率的影響。試驗(yàn)結(jié)果見表1，結(jié)果表明浸提液pH、微波功率、提取時(shí)間和料液比對(duì)莜麥蛋白提取率均有顯著性影響。顯著性分析結(jié)果表明在微波功率280 W、浸提pH 9.5、料液比1∶25（g/mL）、提取時(shí)間8.0 min的條件下，莜麥蛋白提取率最高。

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2 莜麥蛋白微波輔助堿提法工藝優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)（BBD）的試驗(yàn)原理選擇對(duì)莜麥蛋白提取率起主要影響的4個(gè)因素，以莜麥蛋白的提取率為考察指標(biāo)進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，使用Design-Expert軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，求出數(shù)學(xué)模型，進(jìn)而得到最佳的提取條件。莜麥蛋白微波輔助堿提試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1和表2。

利用Design-Expert軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到莜麥蛋白提取率對(duì)微波功率（A）、pH（B）、料液比（C）和微波時(shí)間（D）的回歸方程：

表1 Box-Behnken方案設(shè)計(jì)的因素和水平編碼值表

表2 微波輔助堿法提取莜麥蛋白響應(yīng)面試驗(yàn)方案與試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)該回歸模型方差進(jìn)行分析，具體結(jié)果見表3。由表3可知，模型p＜0.000 1，試驗(yàn)所選用的模型具有高度的顯著性，失擬項(xiàng)p=0.262 8＞0.05，不顯著，決定系數(shù)R2=0.946 9，說明擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，該模型可以用來預(yù)測(cè)莜麥蛋白的提取率，模型中C、B2、C2、D2極顯著，B、D顯著，其他項(xiàng)系數(shù)均不顯著。在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，按照對(duì)結(jié)果的影響排序?yàn)镃＞D＞B＞A，即料液比＞微波時(shí)間＞pH＞微波功率。

表3 回歸方程的方差分析

圖2 兩因素交互作用對(duì)莜麥蛋白提取率的響應(yīng)面圖和等高線圖

等高線是橢圓形則表示兩因素交互作用顯著，是圓形則表示交互作用不顯著，同時(shí)沿因素軸向等高線變化越密集，該因素對(duì)響應(yīng)值影響越顯著，反之越弱。根據(jù)分析結(jié)果做出響應(yīng)面曲面圖及等高線圖，結(jié)果如圖2所示。通過Design-Expert軟件得到微波輔助莜麥蛋白堿提的最佳參數(shù)為微波功率382 W、pH 9.45、料液比1∶22.8（g/mL）、提取時(shí)間7.75 min，預(yù)測(cè)值為79.51%。調(diào)整為微波功率380 W、pH 9.45、料液比1∶23（g/mL）、提取時(shí)間7.75 min，該條件下莜麥蛋白的提取率為79.24%，與理論預(yù)測(cè)值吻合，因此基于響應(yīng)面法所得的優(yōu)化提取參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化莜麥蛋白微波輔助堿法提取工藝，結(jié)果表明微波輔助堿法提取莜麥蛋白的最佳工藝參數(shù)為：微波功率380 W、pH 9.45，料液比1∶23（g/mL）、提取時(shí)間7.75 min。此條件下莜麥蛋白的提取率為79.24%。影響莜麥蛋白微波輔助堿法提取提取率的因素次序?yàn)椋毫弦罕龋疚⒉〞r(shí)間＞pH＞微波功率。與常規(guī)堿法提取莜麥蛋白相比（提取時(shí)間1.15 h，提取率62.02%），微波輔助提取法能大幅減小提取時(shí)間，顯著提高莜麥蛋白的提取率。