應(yīng)用溶劑注入法制備抗耐藥結(jié)核菌藥物利奈唑胺脂質(zhì)體的實(shí)驗(yàn)研究

劉金麗 佟雷 于春艷 劉軍宏 王麗穎

[摘要] 目的 利用乙醇注入法制備利奈唑胺脂質(zhì)體，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化處方及工藝。 方法 單因素考察優(yōu)選出主要影響因素并聯(lián)合Box-Behnken響應(yīng)面法分析篩選出最佳處方及工藝，并以此工藝制備載藥脂質(zhì)體。使用倒置熒光顯微鏡對最佳工藝條件下制備的利奈唑胺脂質(zhì)體進(jìn)行形貌觀察。 結(jié)果 最佳工藝為：膽固醇與卵磷脂的質(zhì)量比1：3、類脂注入緩沖液速度1.2 mL/min、超聲時(shí)間3 min。包封率82.36%，RSD=1.32%，顯微鏡觀察利奈唑胺脂質(zhì)體粒徑較均一，形態(tài)圓整。 結(jié)論 乙醇注入法制備利奈唑胺脂質(zhì)體具有較高的包封率，Box-Behnken響應(yīng)面法可快速全面選取最佳制備工藝，方便準(zhǔn)確。

[關(guān)鍵詞] 耐藥結(jié)核菌;利奈唑胺脂質(zhì)體;乙醇注入法;響應(yīng)面法;包封率

[中圖分類號] R944? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）04-0033-04

Experimental study on preparation of linezolid liposomes against drug-resistant tuberculosis by solvent-injection method

LIU Jinli1? ?TONG Lei2? ?YU Chunyan1? ?LIU Junhong1? ?WANG Liying1

1.Department of infection， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical University， Mudanjiang? ?157011， China; 2.School of Pharmacy， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical University， Mudanjiang? ?157011， China

[Abstract] Objective To prepare linezolid liposome using ethanol injection method and optimize its prescription and preparation using the response surface method. Methods Single-factor experiment was used to select main influencing factors， and Box-Behnken response surface analysis was combined to find the optimal prescription and preparation. The linezolid liposome prepared using the optimal preparation process was observed for morphology by inverted fluorescent microscope. Results Under the optimal preparation process， the mass ratio of cholesterol to lecithin was 1：3， the velocity of lipoid buffer injection was 1.2 mL/min， and the ultrasonic time was 3 min; the entrapment rate was 82.36%， RSD=1.32%. Under microscopic observation， the particle diameter of linezolid liposome was uniform， and the morphology was round. Conclusion The entrapment rate of linezolid liposome prepared by the ethanol injection method is relatively high， and the Box-Behnken response surface method can quickly and comprehensively select the optimal preparation process， which is convenient and accurate.

[Key words] Drug-resistant tuberculosis; Linezolid liposome; Ethanol injection method; Response surface method; Entrapment rate

肺結(jié)核病是一種慢性的由結(jié)核分枝桿菌感染引起的傳染病，由于結(jié)核桿菌寄生于肺泡深處，導(dǎo)致很多情況下用藥效果不好。近年來，利奈唑胺（linezolid）因其較好的抗菌活性而備受關(guān)注，目前利奈唑胺劑型多為口服片劑或注射劑，雖然其具有一定效果，但由于口服或注射后藥物分布全身，進(jìn)入肺部藥量有限，加之利奈唑胺有較多的不良反應(yīng)，如胃腸道反應(yīng)（腹痛、嘔吐等）、頭痛和皮疹等，使其用藥受限，脂質(zhì)體是抗結(jié)核藥物的理想載體，而且脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜相似，可有效實(shí)現(xiàn)藥物傳遞，因此將利奈唑胺制備成脂質(zhì)體直接肺部給藥可使藥物直接作用于病變部位，減少藥物在體內(nèi)其他組織的分布，增加靶區(qū)血藥濃度，延長藥物肺內(nèi)滯留時(shí)間，降低毒副作用。本實(shí)驗(yàn)采用溶劑注入法將利奈唑胺制備成載藥脂質(zhì)體，并考察其最佳制備工藝和處方組成，為其進(jìn)行肺部直接給藥研究奠定基礎(chǔ)[1-8]，現(xiàn)報(bào)道如下。

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)與結(jié)果? 通過單因素考察后確定對脂質(zhì)體包封率影響較大且包封率為最大值時(shí)的三個(gè)主要因素，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)，見表2。對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面曲面分析，建立二元多次回歸方程進(jìn)行回歸分析，見表3。

2.3.2 方程擬合? 采用Design Expert 8.0.8對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程如下：Y=91.17+1.19A+0.45B+1.14AB-0.21AC-0.55BC-9.40A2-7.24B2-7.60C2，由表3可知，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂懈叨蕊@著性（P<0.0001），失擬度P=0.0835>0.05為不顯著的，表明該模型無失擬因素而且模型中主要考察因素P值均小于0.05，模型決定系數(shù)R2=0.9950，R2Adj=0.9886，代表本次試驗(yàn)的預(yù)測值與真實(shí)值相差極小，綜上所述，表明該模型擬合度良好。

2.3.3 響應(yīng)曲面分析? 封三圖4、封三圖6、封三圖8為膽卵比與超聲時(shí)間、注入速度與超聲時(shí)間、超聲時(shí)間與膽卵比三組因素對脂質(zhì)體包封率的響應(yīng)面圖，封三圖5、封三圖7、封三圖9中三組等高線為類橢圓形，等高線與軸線的相交點(diǎn)較多表明被考察因素對脂質(zhì)體包封率的影響均較大，最終得出最佳處方工藝為膽卵比1：3、注入速度1.23 mL/min、超聲時(shí)間3.07 min，根據(jù)操作可行性，確定工藝為膽卵比1：3、注入速度1.2 mL/min、超聲時(shí)間3 min。

2.4 試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

按照最佳工藝方法制備脂質(zhì)體并進(jìn)行包封率測定，得到三批脂質(zhì)體的平均包封率為82.36%，RSD為1.32%，表明該方法制備的脂質(zhì)體質(zhì)量穩(wěn)定。

2.5 最佳工藝下所制脂質(zhì)體外觀形態(tài)觀察及平均粒徑檢測

本實(shí)驗(yàn)以最佳工藝制得的載藥脂質(zhì)體混懸液如封三圖10所示，混懸液呈乳白色，普通光源下通過倒置熒光顯微鏡觀察，可以看出所制備的載藥脂質(zhì)體數(shù)目較多且形貌較為圓整如封三圖11，激光粒度儀檢測平均粒徑在489 nm左右。

3 討論

在制備脂質(zhì)體時(shí)影響脂質(zhì)體制備工藝的因素有很多，若進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，不能進(jìn)行因素與因素之間的相互影響考察，響應(yīng)面法既反映了單一自變量與包封率之間的關(guān)系，又體現(xiàn)出每個(gè)自變量相互間的作用對包封率的影響，使最佳的考察因素不僅僅局限于設(shè)計(jì)試驗(yàn)所選擇的幾個(gè)點(diǎn)，而是存在于一個(gè)由連續(xù)的點(diǎn)構(gòu)成的曲面的極值處，并且僅為一個(gè)點(diǎn)。因此采用響應(yīng)面法進(jìn)行工藝優(yōu)化比常規(guī)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察方法更為優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)所制得脂質(zhì)體粒徑在500 nm左右，粒徑較大，但對于肺部直接給藥，其更有利于肺部對載藥脂質(zhì)體的機(jī)械性濾阻，增加肺部的藥物攝取量，延長藥物在肺內(nèi)的滯留時(shí)間，增加藥物與結(jié)核菌的作用時(shí)間。由于實(shí)驗(yàn)條件和時(shí)間有限，在接下來的實(shí)驗(yàn)中欲采用體外釋放度試驗(yàn)初步考察載藥脂質(zhì)體的緩釋性能，采用肺部滴注的給藥方式對其進(jìn)行肺部直接給藥，并進(jìn)一步考察將利奈唑胺制備成脂質(zhì)體后在體內(nèi)的分布情況及藥物動力學(xué)情況。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 唐神結(jié)，肖和平. 利奈唑胺抗結(jié)核作用的研究及其最新進(jìn)展[J]. 中華臨床醫(yī)師雜志，2010，4（1）：63-64.

[2] 李華. 利奈唑胺治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌性肺部感染的臨床效果觀察[J]. 交通醫(yī)學(xué)，2018，32（2）：157-158，162.

[3] 韓瑞敏. 淺談結(jié)核病防治工作的重要性[J]. 臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)雜志，2016，3（15）：24-31.

[4] Koh WJ，Kang YR，Jeon K，et al. Daily 300 mg dose of linezolid for multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis：Upda-ted analysis of 51 patients[J]. J Antimicrob Chemother，2012，67（6）：1503-1507.

[5] Zhu L，Li M，Dong J，et al. Dimethyl silicone dry nanoemul-sion inhalations：Formulation? study and anti-acute lung injury effect[J]. J Int Pharm，2015，491：292-298.

[6] 辛小娟，黃文祥，李佳俊，等. 利奈唑胺及其耐藥機(jī)制研究[J]. 中國抗生素雜志，2013，38（6）：411-418.

[7] 胡玉貞，李淼，張桐桐，等. 青蒿琥酯脂質(zhì)體粉霧劑的制備及其治療大鼠急性肺損傷的作用[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2016， 51（12）：1906-1907.

[8] 張莉，景年水，李云霞，等. 脂質(zhì)體肺部給藥的研究進(jìn)展[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28（17）：1496

[9] 侯麗芬，谷克仁，吳永輝. 不同制劑脂質(zhì)體制備方法的研究進(jìn)展[J]. 河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016， 37（5）：119-124.

[10] 蘇艷瑩，雷小小，桂卉. 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化山茱萸總環(huán)烯醚萜苷脂質(zhì)體凝膠劑的制備工藝[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，38（11）：1331-1335.

[11] 鄒蔓姝，鐘思雨，周莉莉，等. 斑蝥素半乳糖化脂質(zhì)體制備工藝研究[J]. 中草藥，2018，49（12）：2809-2816.

[12] 王婷玉，厲瑤，張鑫，等. 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化尼莫地平脂質(zhì)體的制備工藝[J]. 廣州化工，2016，44（1）：68-70.

[13] 張勇，趙瑩，葉小玲，等. 腦靶向紫杉醇脂質(zhì)體制備工藝的優(yōu)化[J]. 嘉應(yīng)學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)），2016，34（5）：58-60.

[14] 袁端鋒. 穿膜肽TAT和腦腫瘤靶向肽T7雙修飾脂質(zhì)體的制備和體外靶向性評價(jià)[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2015，50（1）：104-110.

[15] 沈安，葉晶晶，金湛，等. Box-Behnken響應(yīng)面分析法優(yōu)化蛞貝平喘膠囊提取工藝的研究[J]. 浙江中醫(yī)雜志，2019， 54（4）：309-311.

（收稿日期：2019-09-10）