應用溶劑注入法制備抗耐藥結核菌藥物利奈唑胺脂質體的實驗研究

劉金麗 佟雷 于春艷 劉軍宏 王麗穎

[摘要] 目的 利用乙醇注入法制備利奈唑胺脂質體，并通過響應面法優化處方及工藝。 方法 單因素考察優選出主要影響因素并聯合Box-Behnken響應面法分析篩選出最佳處方及工藝，并以此工藝制備載藥脂質體。使用倒置熒光顯微鏡對最佳工藝條件下制備的利奈唑胺脂質體進行形貌觀察。 結果 最佳工藝為：膽固醇與卵磷脂的質量比1：3、類脂注入緩沖液速度1.2 mL/min、超聲時間3 min。包封率82.36%，RSD=1.32%，顯微鏡觀察利奈唑胺脂質體粒徑較均一，形態圓整。 結論 乙醇注入法制備利奈唑胺脂質體具有較高的包封率，Box-Behnken響應面法可快速全面選取最佳制備工藝，方便準確。

[關鍵詞] 耐藥結核菌;利奈唑胺脂質體;乙醇注入法;響應面法;包封率

[中圖分類號] R944? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）04-0033-04

Experimental study on preparation of linezolid liposomes against drug-resistant tuberculosis by solvent-injection method

LIU Jinli1? ?TONG Lei2? ?YU Chunyan1? ?LIU Junhong1? ?WANG Liying1

1.Department of infection， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical University， Mudanjiang? ?157011， China; 2.School of Pharmacy， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical University， Mudanjiang? ?157011， China

[Abstract] Objective To prepare linezolid liposome using ethanol injection method and optimize its prescription and preparation using the response surface method. Methods Single-factor experiment was used to select main influencing factors， and Box-Behnken response surface analysis was combined to find the optimal prescription and preparation. The linezolid liposome prepared using the optimal preparation process was observed for morphology by inverted fluorescent microscope. Results Under the optimal preparation process， the mass ratio of cholesterol to lecithin was 1：3， the velocity of lipoid buffer injection was 1.2 mL/min， and the ultrasonic time was 3 min; the entrapment rate was 82.36%， RSD=1.32%. Under microscopic observation， the particle diameter of linezolid liposome was uniform， and the morphology was round. Conclusion The entrapment rate of linezolid liposome prepared by the ethanol injection method is relatively high， and the Box-Behnken response surface method can quickly and comprehensively select the optimal preparation process， which is convenient and accurate.

[Key words] Drug-resistant tuberculosis; Linezolid liposome; Ethanol injection method; Response surface method; Entrapment rate

肺結核病是一種慢性的由結核分枝桿菌感染引起的傳染病，由于結核桿菌寄生于肺泡深處，導致很多情況下用藥效果不好。近年來，利奈唑胺（linezolid）因其較好的抗菌活性而備受關注，目前利奈唑胺劑型多為口服片劑或注射劑，雖然其具有一定效果，但由于口服或注射后藥物分布全身，進入肺部藥量有限，加之利奈唑胺有較多的不良反應，如胃腸道反應（腹痛、嘔吐等）、頭痛和皮疹等，使其用藥受限，脂質體是抗結核藥物的理想載體，而且脂質體的結構與細胞膜相似，可有效實現藥物傳遞，因此將利奈唑胺制備成脂質體直接肺部給藥可使藥物直接作用于病變部位，減少藥物在體內其他組織的分布，增加靶區血藥濃度，延長藥物肺內滯留時間，降低毒副作用。本實驗采用溶劑注入法將利奈唑胺制備成載藥脂質體，并考察其最佳制備工藝和處方組成，為其進行肺部直接給藥研究奠定基礎[1-8]，現報道如下。

2.3.1 響應面試驗與結果? 通過單因素考察后確定對脂質體包封率影響較大且包封率為最大值時的三個主要因素，根據Box-Behnken試驗設計原理，采用響應面法優化設計，見表2。對試驗結果進行響應面曲面分析，建立二元多次回歸方程進行回歸分析，見表3。

2.3.2 方程擬合? 采用Design Expert 8.0.8對數據進行回歸分析，得到回歸方程如下：Y=91.17+1.19A+0.45B+1.14AB-0.21AC-0.55BC-9.40A2-7.24B2-7.60C2，由表3可知，本實驗模型具有高度顯著性（P<0.0001），失擬度P=0.0835>0.05為不顯著的，表明該模型無失擬因素而且模型中主要考察因素P值均小于0.05，模型決定系數R2=0.9950，R2Adj=0.9886，代表本次試驗的預測值與真實值相差極小，綜上所述，表明該模型擬合度良好。

2.3.3 響應曲面分析? 封三圖4、封三圖6、封三圖8為膽卵比與超聲時間、注入速度與超聲時間、超聲時間與膽卵比三組因素對脂質體包封率的響應面圖，封三圖5、封三圖7、封三圖9中三組等高線為類橢圓形，等高線與軸線的相交點較多表明被考察因素對脂質體包封率的影響均較大，最終得出最佳處方工藝為膽卵比1：3、注入速度1.23 mL/min、超聲時間3.07 min，根據操作可行性，確定工藝為膽卵比1：3、注入速度1.2 mL/min、超聲時間3 min。

2.4 試驗結果驗證

按照最佳工藝方法制備脂質體并進行包封率測定，得到三批脂質體的平均包封率為82.36%，RSD為1.32%，表明該方法制備的脂質體質量穩定。

2.5 最佳工藝下所制脂質體外觀形態觀察及平均粒徑檢測

本實驗以最佳工藝制得的載藥脂質體混懸液如封三圖10所示，混懸液呈乳白色，普通光源下通過倒置熒光顯微鏡觀察，可以看出所制備的載藥脂質體數目較多且形貌較為圓整如封三圖11，激光粒度儀檢測平均粒徑在489 nm左右。

3 討論

在制備脂質體時影響脂質體制備工藝的因素有很多，若進行單因素實驗，不能進行因素與因素之間的相互影響考察，響應面法既反映了單一自變量與包封率之間的關系，又體現出每個自變量相互間的作用對包封率的影響，使最佳的考察因素不僅僅局限于設計試驗所選擇的幾個點，而是存在于一個由連續的點構成的曲面的極值處，并且僅為一個點。因此采用響應面法進行工藝優化比常規的正交試驗設計考察方法更為優化。本實驗所制得脂質體粒徑在500 nm左右，粒徑較大，但對于肺部直接給藥，其更有利于肺部對載藥脂質體的機械性濾阻，增加肺部的藥物攝取量，延長藥物在肺內的滯留時間，增加藥物與結核菌的作用時間。由于實驗條件和時間有限，在接下來的實驗中欲采用體外釋放度試驗初步考察載藥脂質體的緩釋性能，采用肺部滴注的給藥方式對其進行肺部直接給藥，并進一步考察將利奈唑胺制備成脂質體后在體內的分布情況及藥物動力學情況。

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（收稿日期：2019-09-10）