館藏清代《牧牛圖》軸的微生物病害研究

張 諾，徐 森

(南京博物院，江蘇南京 210016)

0 引 言

我國擁有卷帙浩繁的書畫文物。這些書畫文物是古代先人留給我們的極其珍貴的歷史文化遺產，是中華民族寶貴的精神財富。書畫文物流傳至今，面臨著酸氧老化、斷裂脫漿、蟲蛀霉爛，岌岌可危。其中，微生物損害是書畫文物中較為常見的病害。微生物具有分布廣、對環境適應能力強、代謝轉換能力強、繁殖速度快等特點，且在一開始生長的階段很難發現，但當被發現時已經蔓延擴散。組成書畫文物的材料——紙張、絹絲及漿糊等也都是微生物喜好的養料。所以，書畫文物更容易受微生物的侵染。

近年來，微生物技術已經出現在文物保護中，在壁畫、紙質文物、木質文物等方面取得了一定的研究成果[1-4]。這些技術為文物保護開辟了一個全新的領域，如今文物保護微生物學作為一門獨立的學科出現在學術界[5]。利用這些新技術可以研究損害文物的微生物的種類，微生物對壁畫、紙質、木質類文物材質的降解機理，從而為文物的保存及除霉工作提供技術指導。書畫文物受到微生物侵染后，會留下微生物滋生的痕跡，出現黑色、黃色、紅色等斑點，輕則損壞紙張部分纖維，重則使文物腐爛。早在20世紀30年代，人們就注意到紙質文物上出現的黃色、黃褐色、鐵銹色的斑點，稱之為狐斑(fox spots)[6]。目前，關于狐斑的成因，有些研究者更傾向于“生物論”的觀點，即認為狐斑的成因主要可能與某種或某幾種真菌的生長有關[7-8]。Arai[9]從不同紙張的褐色斑點(狐斑)處分離得到25株真菌，并認為這些斑點的形成與高溫、高濕的環境相關，Corte等[10]也從地圖的狐斑樣品中分離得到真菌，并揭示了其與環境的相關性。

為全面了解館藏書畫文物的微生物病害信息，該研究工作包括了以下內容：對淮安楚州博物館舊藏《牧牛圖》軸的畫芯和鑲料及褙紙等處出現的微生物損害展開調查；對《牧牛圖》軸上的黑色污斑和紅色污斑處的微生物進行培養、分離純化及鑒定。該項工作通過對這些污斑的分析檢測探討了微生物的損害機理，可為后續館藏書畫文物的預防性保護工作提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1書畫樣品 書畫樣品來自于《牧牛圖》軸。《牧牛圖》軸為淮安楚州博物館舊藏，其畫芯、鑲料和褙紙等處出現嚴重的污漬和微生物損害。現場調研時發現該圖軸存放的庫房中無溫濕度控制系統、密集柜內也未做防霉處理，致使本體材料出現多處變色，現狀照片見圖1。淮安為國家級歷史名城，該畫作對于研究清代淮安地區的民俗、民風具有重要的意義。

圖1 《牧牛圖》軸病害現狀

1.1.2培養基制備 牛肉膏蛋白胨培養基：依次稱取蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、酵母膏5 g、瓊脂15 g于燒杯中，加入適量的水并加熱使其溶解，后定容至1 000 mL，調pH值至7.4～7.6，1×105Pa滅菌30 min。液體培養基與固體培養基的成分相同，但不加瓊脂。

馬鈴薯葡萄糖培養基：去皮馬鈴薯200 g，加適量的水煮沸30 min后，用八層紗布過濾，濾液中加入葡萄糖20 g、瓊脂15 g，后定容至1 000 mL，自然pH值，1×105Pa滅菌30 min。液體培養基與固體培養基的成分相同，但不加瓊脂。

1.1.3試劑及主要設備 基因組提取采用北京百泰克生物科技有限公司基因組DNA提取試劑盒。聚合酶鏈式反應(PCR)擴增引物：細菌為24F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)、真菌為ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，Taq DNA聚合酶，緩沖液體系(Green PCR試劑)均由南京金斯瑞公司提供。基因序列測定委托蘇州金唯智生物科技有限公司。

PCR儀為德國Biometra公司2720型；凝膠成像系統為美國Bio-Rad公司170-8170型；電泳儀為北京市六一儀器廠DYY-6C型；酸堿度測試計為美國CLEAN儀器pH30型；微波水分儀為德國ABB公司L&W 862型；掃描電子顯微鏡為日本日立公司S-3400N型。

1.2 實驗方法

1.2.1書畫本體分析檢測 采用酸堿度測試計在樣本上選擇4點進行測試。采用微波水分儀測試樣本的含水率。采用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察樣本污漬處的顯微形貌。

1.2.2樣品的采集 用無菌棉簽在樣品污斑處(黑色污斑處為Sample 1，紅色污斑處為Sample 2)輕輕摩擦，后置于無菌水中，震蕩混勻。分別取混勻液100 μL接種于適宜微生物生長的無菌牛肉膏蛋白胨和馬鈴薯葡萄糖固體培養基上。

1.2.3微生物的分離和純化 將接種完的牛肉膏蛋白胨和馬鈴薯葡萄糖固體培養基置于恒溫培養箱中，分別于37 ℃和28 ℃條件下培養，期間陸續在培養基上得到菌落。隨后，采用平板劃線法，接種換取樣于新的培養基中，重復純化3次，最終為單菌落。

1.2.4微生物的形態觀察 采用解剖針刮取少量純化菌株于載玻片上，蓋上蓋玻片，在光學顯微鏡(OM)下觀察形態特征并拍照保存。

1.2.5基因組DNA的提取 細菌總DNA的提取采用細菌基因組DNA提取試劑盒(BacteriaGen DNA Kit)。真菌總DNA的提取方法如下：取適量純培養物置于100 μL微生物裂解試劑盒(Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR)中，于80 ℃中水浴20 min，直接作為DNA模板用于后續PCR。

1.2.6PCR擴增[11]細菌擴增的引物序列為24F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)。PCR反應體系為50 μL，其中24F、1492R各1 μL，Taq酶0.5 μL，10×PCR緩沖液5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)4 μL，MgCl24 μL，DNA模板1.5 μL，無菌雙蒸水33 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸100 s，35個循環；最后72 ℃延伸10 min。真菌ITS基因片段擴增的引物序列為ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。PCR反應體系為50 μL，其中ITS1、ITS4各1 μL，Taq酶0.4 μL，10×PCR緩沖液5 μL，dNTP 4 μL，MgCl23 μL，DNA模板2 μL，無菌雙蒸水33.6 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；58 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s，35個循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增完畢，產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測純度。

1.2.7序列比對 待測細菌的16S rDNA和真菌的內源轉錄間隔區(internally transcribed spacer，ITS)序列經過DNAMAN 6.0軟件校正后，在美國國立生物技術信息中心(NCBI)中進行同源性序列搜索(BLAST search)。

1.2.8酶活測定 由于微生物具有不同的酶學系統，致使它們可以利用不同或者相同的底物產生不同的代謝產物。微生物的活性和生長繁殖與細胞外分泌的酶相關。研究各種胞外酶活性及作用是研究微生物致病機理的一個重要方面。為評估《牧牛圖》軸上分離得到微生物的代謝和破壞能力，采用法國API-ZYM半定量微量方法系統測定了微生物19種胞外酶——堿性磷酸酶、酯酶(C4)、類脂酯酶(C8)、類脂酶(C14)、白氨酸芳胺酶、纈氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-糖醛酸苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、N-乙酰-β-氨基葡糖苷酶、α-甘露糖苷酶、α-巖藻糖苷酶的活性。該試劑盒專為研究酶活性所設計，包括4種酯酶、5種蛋白酶、2種水解酶和8種糖發酵酶。

1.2.9模擬樣品的制備 挑取純化菌株孢子，將孢子分散于馬鈴薯葡萄糖液體培養基中，放入恒溫培養震蕩器中，28 ℃，125 r/min過夜培養制成孢子菌懸浮液。然后用噴霧器將稀釋后的孢子懸液噴灑到宣紙紙樣表面，放入培養箱中，保持濕度為80%、溫度28 ℃。

2 結果與分析

2.1 書畫本體分析檢測結果

樣本的pH值在3.72～5.06范圍，酸度值偏高；樣本的含水率為12%，遠遠超出了紙張正常含水率水平；污斑樣本在掃描電子顯微鏡下放大500倍，可見表面布滿菌絲，如圖2a所示。紙張本體含水率過高會導致微生物的孳生，微生物代謝產生的有機酸又會增加載體的酸度，這些因素造成書畫本體腐蝕、破碎，如圖2b所示。

圖2 《牧牛圖》樣本掃描電子顯微圖

據研究報告[12]，微生物代謝中產生的有機酸主要有檸檬酸(青霉)、葡萄糖酸(青霉和曲霉)、甲酸、乳酸、延胡羧酸、丙酸、五倍子酸、丁烯二酸(根霉)等十幾種酸。這些有機酸同無機酸一樣可明顯加大紙張酸性，使紙張變黃發脆，強度降低，是影響紙張壽命的主要因素。

2.2 分離純化結果

書畫文物Sample 1和Sample 2處共獲得7株細菌和6株真菌，用接種針挑取少量已純化菌株于載玻片上，于顯微鏡下觀察、拍照，其中，F1-1～F1-3為Sample 1處分離純化得到的真菌(圖3a～3c)，F2-1～F2-3為Sample 2處分離純化得到的真菌(圖3d～3f)。

2.3 鑒定結果

利用BLAST檢索對測序結果進行序列比對，結果表明：提交的13個序列分屬于4個細菌屬和5個真菌屬，具體結果見表1和表2。7株細菌屬于4個屬：芽孢桿菌屬(B1-1、B1-2、B2-2)、微球菌屬(B1-3、B2-3)、假單胞菌屬(B1-4)和葡萄球菌屬(B2-1)。6株真菌屬于5個屬：根霉屬(F1-1)、耙齒菌屬(F1-2)、裂褶菌屬(F1-3、F2-3)、蠟質菌屬(F2-1)和腐霉菌屬(F2-2)。

單菌落培養發現：F1-1菌株(Rhizopusoryzae)在培養后期會產生黑色顆粒，而Sample 1為黑色污斑樣品，故F1-1(Rhizopusoryzae)可能與黑色污斑上的污染物相關。而據文獻報道[13]，根霉屬為紙張常見的霉變種屬。同時，F2-3菌株(Schizophyllumcommune)在培養后期會產生紅色色素，這也可能會導致樣品表面產生紅色污漬。為了驗證這種推測，本研究通過模擬實驗(詳見1.2.9部分)，挑取F1-1菌株孢子作為受試菌，將其分散于馬鈴薯葡萄糖液體培養基中，并將制成的孢子菌懸浮液噴灑到宣紙紙樣上。通過一段時間的培養，模擬紙樣上遍布了黑色的斑點。從而，這也證實了推測的可能性，后續將采用質譜等檢測手段做進一步研究。

圖3 油鏡下菌株的顯微形態

表1細菌鑒定結果

Table1Identification of bacterial strains

取樣處菌株編號參考序列號同源菌株種屬相似度/%Sample 1B1-1KP422465.1Bacillus sp. B1408芽孢桿菌屬99B1-2EU685816.1Bacillus sp. PK-14芽孢桿菌屬99B1-3EU182882.1Micrococcus sp. MH54 微球菌屬99B1-4FJ416144.1Pseudomonas sp. BSw10041N假單胞菌屬98Sample 2B2-1EU798945.1Staphylococcus sp. JY04葡萄球菌屬99B2-2EU236740.1Bacillus sp. Z9芽孢桿菌屬99B2-3DQ490458.1Micrococcus sp. KVD-1921-02微球菌屬99

表2 真菌鑒定結果

2.4 酶活測定結果

為探究書畫文物上分離的微生物的生物降解能力，采用API-ZYM系統測定分離得到微生物的4種酯酶(堿性磷酸酶、酯酶(C4)、類脂酯酶(C8)、類脂酶(C14))、5種蛋白(多肽)酶(白氨酸芳胺酶、纈氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶)、2種水解酶(酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶)和8種糖發酵酶(α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-糖醛酸苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、N-乙酰-β-氨基葡糖苷酶、α-甘露糖苷酶、α-巖藻糖苷酶)，結果見表3。本研究發現：分離的細菌的胞外酶主要有酯酶(C4)、類脂酯酶(C8)；真菌的胞外酶主要有堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、酯酶(C4)、類脂酯酶(C8)、白氨酸芳胺酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶及N-乙酰-β-氨基葡糖苷酶。

書畫文物是有機質文物，屬植物纖維類。其主要化學成分是纖維素、半纖維素、木質素，還有少量的果膠、無機鹽等次要成分。絹絲等作為書畫文物的鑲料也常成為微生物的侵蝕對象。纖維素主要是以微纖維的形態存在于細胞壁的初生壁中；半纖維素分布在微纖維中間；木質素等包圍在微細纖維和細纖維周圍。它們三者相互交聯在植物細胞壁的初生壁中。微生物是異養型生物，主要是通過一些胞外酶，將有機質文物中的高分子水解成能通過細胞膜的小分子物質，后者被微生物的細胞吸收利用，這也是文物被腐蝕破壞的過程。這些胞外酶加速了微生物代謝中有機酸和無機酸的產生，酸性物質和一些酶協同又加速了書畫材質的老化。仲雨薇[14]采用蒽酮檢測法分析了菌斑處碳水化合物的含量，并推測得出：霉菌使紙張原本不溶性的纖維素、半纖維素等降解為可溶性化合物，并最終導致污染處的紙張易斷裂。微生物的代謝和產酶與作用底物密切相關，后續將考慮基于纖維素、半纖維素、木質素為單一碳源，分析菌株的產酶特性。

表3 API-ZYM測定結果

注： “+”表示陽性(存在)；“-”表示陰性(不存在)。

3 討 論

微生物病害是書畫類文物較為常見的病害，屬于活動性病害和可誘發性病害[4]，應盡早預防和治理。隨著預防性保護理念的日益深入，監測微生物污染已成為近年來預防性保護研究的一個新方向[3]。López-Miras等[15]采用API-ZYM系統對從油畫上分離得到的細菌和真菌的酶活進行了測定，并認為酯酶和類脂酯酶會造成油畫的損壞。纖維素酶通常包括內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-糖苷酶。曲霉屬、木霉屬、青霉屬被認為能產生高活性的纖維素酶[3]。而不同菌體中，纖維素酶系的組合是各不相同的。本研究采用的API-ZYM系統中沒有涉及到內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶，后續將基于纖維素、半纖維素、木質素為單一碳源，并分析菌株的酶學性質。

紙質文物上孳生微生物的現有研究大多數是針對真菌，尤其是絲狀真菌(俗稱為霉菌)。近年來，越來越多的研究者開始關注細菌對書畫文物的危害。芽孢桿菌屬、假單胞桿菌屬和微球菌屬是其中最常見的菌種[16]。有研究[17]發現：在一套被菌斑嚴重侵蝕的攝影材料中，包括正片、底片、紙質框和玻璃紙的信封，細菌和真菌在同一個生態位置共同的生長。所以，雖然不同細菌對生長環境各有偏好，但是細菌和真菌是可以在紙張這個微環境中共同存在的。許多紙張在久藏后，表面出現各種顏色的斑點，其形成并不一定是細菌或是真菌單方面作用的結果，也可能是兩者協同的效應，這些微生物在載體材料上群居雜生，勢必共同影響著紙張的老化降解。

4 結 論

本研究對淮安楚州博物館館藏的《牧牛圖》軸上黑色污斑和紅色污斑處樣品進行分離及鑒定后發現：分離菌株分屬4個細菌屬和5個真菌屬，主要有芽孢桿菌屬、裂褶菌屬和根霉屬。酶活結果顯示：細菌的酯酶和類脂酯酶與微生物腐蝕相關；真菌的酯酶、類脂酯酶及N-乙酰-β-氨基葡糖苷酶等與微生物腐蝕相關。酯酶類可催化植物纖維細胞壁中酯酶的水解；N-乙酰-β-氨基葡糖苷酶可水解細胞壁和蛋白酶類。這些胞外酶水解造紙纖維細胞壁中脂類和多糖類物質、顏料中的膠料以及鑲料絹絲中的蛋白質。本研究為了解書畫文物侵染的微生物種類和數量及后續保護修復過程提供參考，具有重要的指導意義。

在環境溫度為22～30 ℃、相對濕度大于65%的條件下，書畫的有機材質適宜微生物的生長。因此，根據書畫載體的材質和微生物的類型及其生理特征，可從3個方面制定相關的保護措施：1)控制孢子源頭，通過書畫文物入庫前的檢查，可定期對其進行消毒進而降低存儲空間書畫文物發生霉變的幾率；2)控制環境溫濕度，為保證存儲環境溫度和相對濕度的穩定，可采用空調系統控制，但是適當的自然通風、保持室內空氣的適當流動也是防止微生物孳生的有效方法；3)采用相應的防霉劑。事實上，文物所處的環境不可能做到無菌，微生物防治工作的重點是“防”，如果“防”的工作做好了，“治”就不顯得格外重要。通過定期對書畫文物及存放空間中的微生物進行檢測，評價微生物污染的狀況，檢測方法可參照《館藏文物保存環境質量檢測技術規范》(WW/T 0016—2008)，從而建立微生物綜合防治體系，為科學有效解決微生物病害提供保障。