Omega-3多不飽和脂肪酸衍生物18-HEPE對人子宮內膜癌細胞株侵襲的抑制作用研究

李杰萍，鄒建平，江絮萍，楊 琳，劉桐宇，謝 榕

(1．武警福建總隊醫院 a．檢驗科；b．婦產科, 福州 350003；2．福建省腫瘤醫院婦科腫瘤外科，福州 350014)

多不飽和脂肪酸(poly unsaturated fatty acids, PUFAs)作為一類獨特的生物活性物質對人體有重要的生理功能，主要包含omega-3 PUFAs和omega-6 PUFAs兩大類，它們都是合成類二十烷酸化合物的前體，具有穩定細胞膜功能、調控基因表達、維持細胞因子和脂蛋白平衡、抗癌、抗炎和抗心血管病等生理功能，是目前營養生化研究熱點之一[1]。隨著時間的推移和社會經濟的發展變化，特別是近100～150年以來，人類的膳食結構發生巨大變化。人類食物中omega-3 PUFAs含量明顯減少，而omega-6 PUFAs含量明顯增多，造成人類攝入的omega-3 PUFAs與omega-6 PUFAs比值嚴重失調。高omega-6/omega-3 PUFAs比值的膳食引發一系列慢性疾病如腫瘤、心血管疾病、糖尿病和自身免疫性疾病等，增加攝入omega-3 PUFAs對于保持身體健康和預防多種慢性疾病有著極為重要的意義[2-5]。Omega-3 PUFAs除了通過結合其受體發揮生物學功能外，還通過其衍生物或代謝產物發揮作用[2,6]。我們以前的研究表明，omega-3 PUFAs衍生物(5Z,8Z,11Z,14Z,16E)-18-羥基-5,8,11,14,16-二十碳五烯酸[(5Z,8Z,11Z,14Z,16E)- 18-Hydroxy-5,8,11,14,16icosapentaenoic acid，18-HEPE]能有效抑制黑色素瘤細胞的肺轉移[7]。本研究我們探討18-HEPE對子宮內膜癌(endometrial cancer, EC)細胞侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 人EC細胞株HEC-1B和RL952細胞購自中國科學院典型培養保藏委員會細胞庫。HEC-1B細胞用含有10 g/dl滅活小牛血清、100 IU/ml青霉素、100 μg /ml鏈霉素的DMEM高糖培養基；RL95-2細胞采用含10 g/dl滅活小牛血清、100 IU/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、NaHCO3及胰島素的DMEM/F12培養基，置37 ℃、5 ml/dl CO2飽和濕度的培養箱內培養。

1.2 主要試劑和儀器 Trizol試劑盒購自美國Ambion公司；熒光定量PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司；Transwell小室購自美國Coming公司；Matrigel基質膠購自美國BD公司；18-HEPE購自美國Cayman公司；抗MMP-2抗體、抗MMP-9抗體和抗PTEN抗體購自美國Santa Cruz公司；GAPDH抗體購自北京中山公司。實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；低溫高速離心機購自美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 侵襲實驗：腫瘤細胞的侵襲潛力通過體外Transwell小室實驗來評估，實驗按照說明書進行。首先，用Matrigel覆蓋Transwell板上室，將含不同濃度的18-HEPE處理的細胞(5×105)于無血清培養基中加入上室，500 μl含 FBS的培養基加入下室，培養24 h后，將Transwell小室取出，小心擦去上層細胞，晾干后，固定、染色，于顯微鏡下隨機選取5個視野，計算穿膜細胞數。實驗重復3次，取其平均值。

1.3.2 實時定量PCR分析:收集細胞后，加入Trizol試劑提取RNA，逆轉錄為cDNA后進行實時定量PCR。IL-6上游引物：5’-TCCAGTTGCCTTCTTGGGAC-3’，下游引物：5’-GTGTAATTAAGCCTCCGACTTG-3’；GAPDH上游引物：5’-CGACTTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC-3’，下游引物：5’-TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT-3’。 反應條件為93 ℃變性2 min，然后按93 ℃ 30s，55 ℃ 1min，72 ℃ 30s，共35個循環，最后72 ℃延伸10 min。樣本結果均用GAPDH標化，每個樣本設3個復孔，采用2-ΔΔCt計算相對表達量。

1.3.3 Western blot分析 ： 樣品進行SDS-PAGE后，電轉移至硝酸纖維素膜，然后用50 g/L脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，棄溶液，加入用50 g/L脫脂奶粉稀釋的一抗，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次后，加入用50 g/L脫脂奶粉稀釋的二抗(辣根過氧化物酶偶聯的羊抗兔/羊抗鼠IgG)，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次后，用化學發光法顯色5 min，壓片顯影。

2 結果

2.1 18-HEPE明顯抑制EC細胞的侵襲 Transwell小室侵襲實驗結果見圖1。18-HEPE在50～200 pg/ml的濃度范圍內以劑量依賴性抑制EC細胞HEC-1B和RL95-2的侵襲。

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 圖1 18-HEPE抑制EC細胞侵襲

2.2 18-HEPE抑制EC細胞侵襲相關基因的表達 見圖2。本研究采用Western Blot實驗進一步觀察18-HEPE對EC細胞侵襲相關基因的影響，結果發現100 pg/ml 18-HEPE明顯抑制HEC-1B和RL 95-2細胞MMP-2和MMP-9的表達。

圖2 18-HEPE明顯抑制EC細胞MMP-2和MMP-9的表達

2.3 18-HEPE抑制EC細胞IL-6的表達 見圖3。由于炎性因子在腫瘤侵襲過程中起重要的作用，本研究探討了18-HEPE 對EC細胞IL-6表達的影響。實時定量PCR實驗結果顯示，100 pg/ml 18-HEPE能明顯抑制HEC-1B和RL 95-2細胞的IL-6表達。

圖3 18-HEPE抑制EC細胞IL-6表達(*P<0.05)

2.4 18-HEPE升高EC細胞中PTEN的表達 見圖4。由于抑癌基因PTEN缺失或突變在EC的發生發展中是極為重要的分子事件，為了進一步探討18-HEPE抑制EC細胞侵襲的相關機制，本研究觀察了18-HEPE對EC細胞PTEN表達的影響。結果發現，100 pg/ml 18-HEPE處理細胞后能明顯上調EC細胞中PTEN的表達。

3 討論

脂類代謝參與調節細胞的生長、增殖、分化等多種生命活動，細胞膜中脂肪酸代謝的改變(尤其是PUFAs)影響細胞的結構、功能、細胞的氧化狀態以及信號通路，從而改變細胞的特性，與腫瘤、心血管疾病和糖尿病等慢性疾病的發生發展密切相關[3,8]。Omega-3 PUFAs主要包括α-亞麻酸(α-Linolenic acid, ALA)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid, DHA)，ALA主要來源于核桃、亞麻子和菜籽等植物油，而EPA和DHA主要來源于深海魚油；omega-6 PUFAs主要包括亞油酸和花生四烯酸，主要存在于玉米油、葵花子油和紅花油中[9]。Omega-3 PUFAs和omega-6 PUFAs在生物體內的代謝是一個復雜的過程，在體內有各自的代謝途徑，但在相同的代謝步驟中所需的酶為同一酶系，存在著代謝競爭抑制，omega-3 PUFAs和omega-6 PUFAs相互影響機體合成類廿碳烷酸化合物的速度；omega-6 PUFAs的代謝產物具有強炎性作用，而omega-3 PUFAs的代謝產物具有低炎性作用或者具有強抗炎作用；在機體內，omega-3 PUFAs拮抗omega-6 PUFAs的生理功能，以維持其體內平衡[1]。Omega-3 PUFAs可以通過直接結合其機體細胞中的受體或者通過其衍生物、代謝產物影響機體細胞的特性，還可以通過降低機體局部組織的炎性水平改變腫瘤發生發展的微環境，從而影響腫瘤的發生發展、侵襲轉移等多個環節，對腫瘤的防治具有重要意義[6,10-11]。

EC是一種常見的女性生殖系統腫瘤，近年來，我國的EC發病率逐年升高，居女性生殖系統腫瘤第二位[12]。流行病學研究表明，多攝入魚或EPA/DHA明顯降低EC發生率[13-16]。Omega-3與omega-6 PUFAs比值也與EC風險負相關[13]。小鼠接種EC細胞后，與用低omega-3 /omega-6 PUFAs比值飲食喂養的小鼠相比，用高omega-3/omega-6 PUFAs比值飲食喂養的小鼠的癌細胞中mTOR和AKT表達明顯降低[17]。細胞實驗結果表明，DHA可以通過抑制mTORC1/2信號通路抑制EC細胞的增殖、遷移及誘導EC細胞凋亡，還可以抑制他莫西芬誘導的子宮內膜生長[18]。這些研究都顯示，omega-3 PUFAs可以抑制EC的發生發展。但是目前還沒有有關omega-3 PUFAs與EC侵襲的研究報道。

本研究表明，EPA衍生物18-HEPE能抑制EC細胞的侵襲相關基因MMP-2，MMP-9的表達以及炎性因子IL-6分泌，從而抑制其侵襲。腫瘤組織局部微環境中的炎性反應對腫瘤的侵襲有著重要作用。研究表明，IL-6可以誘導其下游基因(如：Cyclin D1和MMP-2等)表達，參與雌激素介導的EC生長與侵襲[19]。雌激素能促進EC細胞合成分泌IL-6，分泌的IL-6上調局部組織中基質細胞芳香化酶的表達，進而增強局部組織的雌激素生物合成，這種正反饋機制在EC的發生發展中起到至關重要的作用[20]。這些結果表明，18-HEPE可以通過多種環節影響EC細胞的侵襲。在EC的發生發展機制中，PTEN的突變或者缺失是常見和非常重要的分子事件，PTEN可以通過PIP3-AKT信號通路抑制細胞的生長增殖、黏附侵襲和轉移；PTEN還可以通過AKT信號通路抑制NFkB活性，進一步抑制下游炎性基因的表達，從而影響局部組織的炎性反應[21-22]。我們的研究表明，18-HEPE可以上調EC細胞中PTEN的表達。EC細胞中PTEN表達升高可能抑制腫瘤侵襲相關基因MMP-2和MMP-9的表達以及炎癥因子IL-6的表達。至于18-HEPE如何上調EC細胞中PTEN的表達需要進一步研究。

采用fat-1轉基因小鼠模型研究表明，18-HEPE可以下調肝組織TNF-α水平，抑制肝臟的炎癥，從而抑制肝臟腫瘤的發生[23]。我們以前的研究表明，18-HEPE可以直接抑制黑色素瘤細胞CXCR4的表達和炎性反應水平，從而抑制其肺轉移[5]。這些研究都表明，18-HEPE在預防腫瘤的發生發展中具有重要作用，是一種重要的omega-3 PUFAs衍生物，將有廣闊的臨床應用前景。