液相色譜-串聯質譜法檢測肝癌細胞N6-甲基腺嘌呤核苷甲基化水平

李盛建，王 慧，呂 磊，李群英，須秋萍，周艷卿，張國慶，趙 亮

(1. 上海寶山區羅店醫院藥劑科，上海 201908；2. 上海東方肝膽外科醫院藥劑科，上海 200438)

表觀遺傳，是指在DNA堿基序列不發生變化，其表型或基因表達發生了可穩定遺傳的變化，包括DNA甲基化修飾、RNA甲基化修飾及非編碼RNA等。目前研究中，DNA甲基化修飾為較清楚的表觀遺傳學修飾，其影響基因表達、蛋白功能等重要生命過程；同時，轉錄后多達100多種RNA修飾被認為豐富了RNA功能和遺傳多樣性，N6-甲基腺嘌呤核苷(N6-methyladenosine，m6A)和5-甲基胞嘧啶核苷是其中最具有代表性的甲基化修飾，而m6A更為普遍，在RNA甲基化修飾中超過80%[1]。近年來，m6A相關的研究涉及RNA翻譯效率[2]、DNA損傷修復[3]、生長發育[4]、腫瘤形成[5]等等，可見其重要性。

由于液相色譜-串聯質譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)具有快速、靈敏、準確性高、檢測限低等特點，其應用在表觀遺傳領域中漸漸嶄露頭角，如基因組羥甲基胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶修飾等研究[6-7]，但m6A甲基化修飾的LC-MS/MS分析方法國內外鮮有報道。本研究通過建立一種穩定可靠的LC-MS/MS法測定腺嘌呤核苷(adenosine，A)和m6A含量，分析肝癌細胞株HepG2的m6A甲基化水平，并與正常肝細胞株L02進行比較。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 本研究采用的細胞為人源肝癌細胞株HepG2和正常肝組織細胞株L02，均由上海東方肝膽外科醫院信號轉導實驗室惠贈。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器：Agilent 1290 UPLC二元液相色譜系統, Agilent 6470 Triple Quad質譜儀(美國Agilent)；METTLER AE 240型電子天平(瑞士METTLER TOLEDO)；低溫離心機(美國Thermo Fisher)；Millipore超純水儀(美國Millipore)。

1.2.2 試劑：對照品腺嘌呤核苷和對乙酰氨基酚(中國食品藥品檢定研究院)，N6-甲基腺嘌呤核苷(美國SELLECK CHEMICALS)，Trizol，Ambion?Dynabeads mRNA Purification Kit，mRNA RiboMinusTMHuman Transcriptome Isolation Kit(美國Thermo Fisher)，甲醇、乙腈為色譜純(美國Honeywell)，甲酸為色譜純(美國SIGMA)，水為超純去離子水，其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 mRNA的提取和酶解:取對數期生長的HepG2和L02細胞，細胞數量(1～5)×106個；按TRI Reagent?試劑說明書步驟，采用Trizol法提取總RNA；按照Ambion? Dynabeads mRNA Purification Kit和RiboMinusTMHuman Transcriptome Isolation Kit試劑盒說明書中的步驟從總RNA中分離純化mRNA及去除rRNA；用Nanodrop測定mRNA濃度。取200 ng mRNA，2.5 μl 緩沖鹽溶液(10×，20 mmol/L ZnCl2，100 mmol/L NaCl)和1 μl核酸酶至EP管，加雙蒸水補齊至25 μl，37°C下反應2h；反應體系中再加入2.5 μl酶緩沖溶液和1 μl堿性去磷酸酶，37°C下反應2h；在反應體系中加入去離子水稀釋至200 μl，-80℃冰箱保存待檢測。

1.3.2 溶液的配制：分別精密稱A，m6A及對乙酰氨基酚對照品10 mg，置于10 ml 容量瓶中，加甲醇溶解，配成1.00 mg/ml對照品儲備液；用甲醇按比例逐級稀釋配制不同濃度工作液，其中A，m6A混合對照品溶液濃度分別為30.00，100.00，200.00，400.00，2 000.00，10 000.00 ng/ml和3.00，10.00，20.00，40.00，200.00，1 000.00 ng/ml，質控儲備液濃度分別為40.00，4 000.00，8 000.00 ng/ml和4.00，400.00，800.00 ng/ml，對乙酰氨基酚內標溶液濃度為20.00 ng/ml。上述對照品儲備液置4℃冰箱保存。

分別取10 μl上述對照品工作液，加到190 μl含有酶及酶解緩沖液的空白水基質中，配成m6A與A系列濃度工作液樣品。A的質量濃度為1.50，5.00，10.00，20.00，100.00和500.00 ng/ml，隨行質控樣品低、中、高質量濃度分別為2.00，200.00和400.00 ng/ml；m6A的質量濃度為0.15，0.50，1.00，2.00，10.00，和50.00 ng/ml；低、中、高質量濃度質控樣品分別為0.20，20.00和40.00 ng/ml。

1.3.3 色譜及質譜條件：色譜條件：色譜柱為美國Agilent Proshell 120 EC-C18(3.0×100 mm，2.7 m)，預柱：Agilent UPLC Guard SB C18(3.0×5 mm，2.7μm)柱溫：30℃。流動相系統：水(0.1%FA)∶甲醇=82∶18(v/v)等度洗脫，分析時間3 min，進樣量2 μl。質譜條件：采用AJS ESI正離子模式，ESI源參數設置：干燥氣溫350℃；干燥氣流速10 L/min；霧化器壓力40 psi；鞘氣溫度350℃；鞘氣流速11 L/min；毛細管電壓4 000 V；噴嘴電壓2 000 V。動態多反應監測模式參數設置：A檢測參數268.0→136.0，碎片電壓90V，碰撞能量15 eV；m6A檢測參數282.0→150.0，碎片電壓70V，碰撞能量15 eV；內標檢測參數152.3→110.0，碎片電壓110V，碰撞能量17 eV。

1.3.4 待測樣品前處理：取待測細胞樣品30 μl于1.5 ml EP管中，加入60 μl對乙酰氨基酚內標 (10 ng/ml )，渦旋30 s，4 ℃條件下12 000 g離心5 min；取上清液于進樣瓶中，用于LC-MS/MS檢測。

2 結果

2.1 LC-MS/MS 方法學驗證

2.1.1 方法專屬性： 分別取30 μl空白基質、對照品溶液和待測細胞樣品，按“1.3.4”項步驟處理(處理空白基質時，內標用甲醇代替)，按“1.3.3”項條件下進樣分析(見圖1)，A保留時間為1.3min， m6A保留時間為1.4 min，內標保留時間為2.4 min，對照品溶液和待測細胞樣品中待測分析物出峰時間一致，無雜質干擾峰，峰形良好。結果表明，該方法具有良好的專屬性。

A.空白基質，B.低濃度質控樣品，C.待測樣品圖1 待測物與內標多反應監測色譜圖

2.1.2 標準曲線范圍與定量下限: 分別取“1.3.2”項中配制好的對照品溶液30 μl，按“1.3.4”項操作，分別配成6個濃度的標準樣品，每濃度點配制5份樣品，連續進樣分析，記錄色譜圖，以濃度 (X)為橫坐標，各待測物的峰面積與內標的比值(Y)為縱坐標進行回歸計算，權重系數1/x2，求得回歸方程A:Y= 0.040 6X- 0.035 9,r=0.999 9，線性范圍為1.50 ～ 500.00 ng/ml；m6A:Y= 0.010 3X- 0.000 9,r= 0.9999，線性范圍為0.15 ～50.00 ng/ml。A和m6A分別在1.50 ～500.00 ng/ml和 0.15～50.00 ng/ml范圍內具有良好的線性關系，定量限分別為1.50 ng/ml和0.15 ng/ml。

2.1.3 精密度和準確度實驗: 按“1.3.2”和“1.3.4”項中的方法制備低、中、高三種濃度的質控樣品，每個濃度平行操作5份，進樣分析，連續3 天，將被測物和內標的峰面積比值代入標準曲線方程計算實際樣品濃度，精密度用相對標準偏差(RSD)表示，結果見表1。m6A日內精密度RSD<13.77 %，日間精密度RSD<11.50 %。A日內精密度RSD<7.84%,日間精密度RSD<5.78%。準確度以相對回收率表示，實測濃度與理論加入濃度的比值即為相對回收率，結果m6A日內、日間準確度范圍在93.67 %～101.07 %。A日間、日內準確度范圍98.58%～101.10%。提示該方法的精密度和準確度均能達到檢測要求。

表1 待測物日間、日內的精密度與準確度(n=5)

2.1.4 基質效應和提取回收率：按“1.3.2”和“1.3.4”項中的方法制備含待測物低、中、高濃度的質控樣品；按“1.3.5”項方法處理空白基質(內標用甲醇代替)，取上清溶液，加入一定量質控濃度對照品儲備溶液，使其最終濃度分別與質控樣品的進樣濃度一致；配制待測物的甲醇溶液，其最終濃度分別與質控樣品的進樣濃度一致。進樣得峰面積，計算含基質與不含基質樣品的峰面積之比，得到相應物質的基質效應；計算基質存在下，前處理和后處理加標樣本的峰面積比值，得到待測物的提取回收率。考察內標的基質效應和提取回收率與上述操作一致。結果低、中、高三種濃度待測物及內標提取回收率均在91.46 %～97.60 %之間，基質效應均在90.26 %～99.27 %之間(見表2)。結果表明回收率滿足定量要求，基質效應對待測物的定量不產生明顯的影響。

2.1.5 穩定性考查：按“1.3.2”和“1.3.4”項中的方法制備含待測物低、中、高濃度的質控樣品，考察按以下方式處理后樣品的穩定性：室溫放置6 h后處理；處理后室溫放置24 h；三個凍融循環；-80℃保存30天。測定樣品實際濃度并計算RSD和相對偏差(RE)，計算公式：RE %=(實測值-真實值)/ 真實值×100 %。結果RSD%均小于15.0 %，RE的范圍為0.4 % ～ 6.9 %，表明樣品在上述處理狀態下穩定性良好。

表2 待測物及內標提取的回收率和基質效應

注：IS: Internal Standard

2.2 樣品分析 取“1.3.1”項的HepG2和L02待測樣品，按“1.3.4”項處理進樣分析。按內標法計算樣品中m6A和A的濃度，并根據下列公式計算mRNA中m6A甲基化百分比：m6A %=(Cm6A/ Mm6A)/(CA/MA+Cm6A/Mm6A)，Mm6A和MA分別為m6A和A的摩爾質量，Cm6A和CA分別為m6A和A的樣品實測濃度。對m6A甲基化水平進行統計分析，差異有統計學意義(P<0.05)，表明肝癌細胞株HepG2的m6A甲基化水平高于正常肝細胞株L02。

表3 細胞株HepG2和L02的m6A甲基化水平

3 討論

目前傳統的m6A甲基化分析技術主要有斑點雜交法[8]、酶聯免疫吸附法[9]和免疫共沉淀法[10]等，但這些分析方法存在半定量或定量效率不高等問題，LC-MS/MS法與之相比，分析方法穩定、靈敏度高、選擇性好、操作簡便等優點[11]。

本方法首先從細胞中提取mRNA,并使用酶解法將mRNA消化為核苷，最后通過LC-MS/MS法檢測樣品中m6A和A的相對濃度，從而計算m6A甲基化水平。該方法直接測定核苷的相對濃度，需要核酸酶和堿性去磷酸酶將RNA水解為單個核苷，但由于酶活性和消化時間等因素可能存在RNA酶解不完全導致測定誤差。為了消除這一問題，我們在預實驗中考察了核酸酶和堿性去磷酸酶的反應濃度和反應時間，最終確定“1.3.1”項下RNA消化條件最為合適。為提高目標化合物的響應，對質譜參數進行了優化。ESI離子源中，在正、負離子模式下，m/z 50～400范圍內進行全掃描，選取響應較強、干擾較小的作為定量離子對，以確定合適的母離子和子離子。在多反應離子監測模式下，優化了m6A，A和內標的碰撞能量，提高其響應度。最終采用m/z 282/180，m/z 268/136和m/z 152/110分別作為m6A，A和內標的定量離子對。本研究中待測物為細胞中的內源性化合物，難以獲取空白基質，定量分析內源性化合物主要有代替物分析法和代替基質分析法。代替物分析法指選擇合適的待測物替代分析物(如同位素等)加入真實的生物基質中配置標準曲線；代替基質分析法指待測物在替代基質(水、純有機溶劑等)中配置標準曲線[12]。在預實驗中，我們考察了同位素代替物與待測物響應值的等效性，發現兩者之間有較大的差異，代替物分析法無法應用于本研究；經純化后的待測樣品基質組成較簡單，主要由少量鹽與蛋白酶組成，因此本研究采用了含酶和酶緩沖液的水作為代替基質測定m6A與A的濃度。在肝癌疾病中m6A是一種抑癌因子，甲基轉移酶METTL-14的下調導致m6A甲基化水平降低，進而促進腫瘤細胞的轉移[8,13]。采用本方法測得的肝癌細胞株HepG2的m6A甲基化水平低于正常肝細胞L02，結果與上述研究相符，提示該方法測試結果的準確性。

總之，本研究建立的LC-MS/MS法，具有快速、靈敏、準確性高、檢測限低等特點，能進一步應用于m6A甲基化的生物學功能研究中。