CIM，mCIM和MHT篩選腸桿菌科細菌產碳青霉烯酶的方法評價

曹 蕾，李小月 ，羅慶禮 ，王亞平

(1.安慶市第一人民醫院檢驗科，安徽安慶 246003；2.安徽醫科大學病原生物學教研室，合肥 230000)

近年來，耐碳青霉烯的腸桿菌(carbapenem-resistant Enterbacteriaceae，CRE)引起了廣泛關注，而產碳青霉烯酶是引發耐藥的主要機制[1]。有報道顯示，產碳青霉烯酶的CRE(carbapenemase-producing carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CP-CRE)比非CP-CRE毒力、致病力更強[2]，并能通過耐藥質粒引起播散。明確CP-CRE診斷，有利于感染的控制和播散。因而，一種高效、簡便、準確篩選碳青霉烯酶的方法尤為重要。

本實驗選取三種操作簡便、無需特殊儀器的方法：改良Hodge試驗(modified Hodge test, MHT)，碳青霉烯類失活法(carbapenem inactivation method，CIM)和改良碳青霉烯類失活法(modified carbapenem inactivation method，mCIM)，結合本地區腸桿菌細菌耐藥情況，以PCR作為金標準，評估三種方法的表型篩選能力。

1 材料和方法

1.1 研究方向 收集安慶地區2013年01月～2017年12月臨床分離的腸桿菌科細菌，挑選120株CRE，即對亞胺培南的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)≥4，其中肺炎克雷伯菌73株，大腸埃希菌24株，陰溝腸桿菌9株，產氣腸桿菌5株，弗氏枸櫞酸桿菌5株和黏質沙雷菌4株。50株碳青霉烯類敏感的腸桿菌科細菌中大腸埃希菌30株，肺炎克雷伯菌20株。

1.2 試劑與儀器 全自動微生物分析儀VITEK 2 Compact及配套板卡，哥倫比亞血瓊脂、水解酪蛋白培養基(法國生物梅里埃公司)；藥敏紙片(英國Oxoid公司)；PCR擴增儀、凝膠成像儀和電泳儀(美國伯樂公司)； 2×Es Taq MasterMix(北京康為世紀公司)；50×TAE，瓊脂糖和胰蛋白胨大豆肉湯(Tryptic soy broth,TSB)(上海生工生物公司)，引物由大連寶生物公司合成。

1.3 方法

1.3.1 碳青霉烯酶表型的檢測：分別參照文獻[3-5]進行CIM，mCIM和MHT試驗及結果判讀。

1.3.2 碳青霉烯酶基因檢測：采用加熱煮沸法提取菌株 DNA 作為 PCR模板。參照文獻[6]合成碳青霉烯酶基因 blaKPC ，blaNDM，blaVIM，blaIMP，blaGES，blaOXA-48和blaOXA-23引物。 PCR擴增體系 20μl：上、下游引物( 10mmol / L) 各 1μl，2×Taq Master Mix 10μl，ddH2O 7μl，模板 1μl。PCR擴增參數: 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s，56 ℃30 s，72 ℃ 1 min，共 30 個循環; 72 ℃7min。擴增產物經 12 g / L 瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。PCR擴增陽性產物由大連寶生物公司進行雙向測序，測序結果經 BLAST 比對分析以確定基因型。

1.4 統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行統計學分析，分別計算CIM，mCIM和MHT的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值，并進行一致性分析，分別計算CIM， mCIM，MHT和PCR結果的一致率和kappa值。kappa值在0.41～0.60之間，表示一致性強度中等，kappa值在0.61～0.80之間，一致性強度為高度；kappa值在0.81～1.00之間，一致性強度為完全一致。

2 結果

2.1 耐藥基因檢測結果 見表1。120株CRE中，93株攜帶一種或多種耐藥基因，27株未檢出耐藥基因。除blaGES基因外，其他基因型均有檢出。50株碳青霉烯類敏感的腸桿菌科細菌未發現基因型。

表1 PCR,CIM,mCIM 和MHT試驗陽性結果分布(株)

2.2 CIM,mCIM 和MHT試驗結果 120株CRE中，CIM試驗陽性87株，陰性33株；mCIM 試驗陽性94株，陰性26株；MHT試驗陽性72株，陰性48株。三種方法篩選碳青霉烯酶，差異有統計學意義(χ2=12.796，P<0.05)。50株碳青霉烯類敏感的腸桿菌科細菌三種方法均陰性。

2.3 三種方法性能評價 見表2。以PCR結果作為金標準，對三種方法檢測CRE的性能進行評價，mCIM試驗的敏感度、特異度和陽性預測值均高于另外兩種方法。與PCR結果相比較，CIM，MHT和mCIM的一致率分別為90%，95%和77.4%，Kappa值分別為0.898，0.949和0.771。mCIM和CIM試驗與PCR高度一致。

表2CIM,mCIM和MHT試驗檢測CP-CRE性能評價

評價指標CIMmCIMMHT敏感度(%)95.696.895.8特異度(%)72.792.350陽性預測值(%)90.397.874.2陰性預測值(%)88.988.988.9一致率(%)909577.4Kappa值0.8980.9490.771

3 討論

臨床微生物實驗室快速準確地檢測CP-CRE的能力，是有效控制和預防病原菌播散的重要因素，也是實驗室管理的一個至關重要的組成部分[7]，腸桿菌科細菌產碳青霉烯酶是導致耐藥的主要機制，該酶常處于可移動的質粒上，細菌通過轉移耐藥質粒將耐藥性傳遞給其他菌株引起播散。因而，對碳青霉烯酶的快速檢測將有利于臨床及早采取隔離措施，避免耐藥菌的進一步播散。實驗室快速鑒定CP-CRE是控制其擴散的重要一環，約有55%的實驗室使用PCR的方法來進行鑒定，但耐藥基因檢測也存在一些缺陷，對實驗室條件、人員、技術要求較高，同時也會受檢測的基因數量，引物突變等因素的影響而出現假陰性[8]，本研究中就有三株細菌，CIM,mCIM 和MHT試驗均陽性，但未檢測到試驗中擴增的這6種基因型，原因可能是因為CRE耐藥基因多樣，而研究中選擇擴增的基因有限。也可能是操作失誤或是引物突變而出現的假陰性，具體原因仍需實驗論證。雖然目前PCR檢測耐藥基因仍舊是金標準，是流行病學監測和感染防治的基礎，但是，基因檢測有其不能避免的缺點，因而，仍需要一種快速經濟的表型檢測方法。表型檢測提供了一種成本效益高的篩選過程可快速區分CP-CRE和非CP-CRE，避免不必要的分子檢測，且不受已知基因突變或分子靶點數量的限制[9]，也無需特殊儀器，人員要求不高，有利于基層實驗室中開展。

本研究發現，mCIM試驗敏感度、特異度和一致率高于CIM試驗，與其他國內外相關報道一致[10-11]。CIM試驗是由VAN DER IWALUW等[3]在2015年提出的一種操作簡便、成本低廉、敏感度高的檢測方法，2017年CLSI改良該方法-mCIM正式納入標準，用于流行病學調查和感控研究。mCIM試驗用TSB替代生理鹽水，并將孵育時間延長至4 h，更有利于細菌的生長，產酶量更充足、水解更充分，同時，可以增強對水解活性較弱、表達水平較低的或需要二價陽離子才能激活的金屬酶(B組耐藥基因)的檢測，使得敏感度更高[12-13]。TAMMA等報道[14]，CIM試驗在blaKPC,blaNDM 和blaOXA-48基因型上敏感度不及mCIM，本研究中發現mCIM對blaKPC,blaNDM敏感度可達100%。且mCIM試驗不受菌齡、藥敏紙片以及細菌是否產黏液影響，使其敏感度和特異度更好。但mCIM試驗在結果判讀中存在一個不確定的范圍，即與待測細菌菌液共孵育的美羅培南紙片，若其抑菌圈直徑為16～18mm，則需要再次驗證，易導致實驗結果的誤判。目前，mCIM試驗僅被CLSI推薦用于CRE的檢測，但是耐碳青霉烯的其他細菌(如：銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌)日益增多，其在這些細菌表型檢測中的意義如何，仍需更多試驗證實。

與mCIM試驗相比，MHT步驟更為簡單，耗時短，并且對于A 組(如：blaKPC)和D組(如：blaOXA-23)碳青霉烯酶顯示較好的檢測能力，但是對于B組金屬酶(如blaNDM，blaVIM，blaIPM)的檢測存在缺陷，造成該實驗總體的敏感度低于其他兩種方法，也低于相關報道[15]。另外，研究中發現有兩株未檢測到基因型，且另兩種方法均陰性的菌株，MHT試驗陽性，有文獻報道細菌產ESBLs或者存在高水平的AmpC酶，會導致結果出現假陽性[16-17]。

相比較而言，mCIM試驗檢測CP-CRE的性能均高于CIM和MHT，可作為合適的碳青霉烯酶表型篩選試驗。