伊洛河馬口魚遺傳差異及其種群分化研究

鄧 艷 王 雪 林鵬程 劉煥章 王緒禎

(1. 中國科學院水生生物研究所中國科學院水生生物多樣性與保護重點實驗室, 武漢 430072;2. 中國科學院大學, 北京 100049)

物種是生物進化的基本單元[1], 物種的識別和物種分化研究是生物多樣性研究的重要領域。物種是由種群構成的, 種群的個體之間具有潛在的可交配的能力, 并且與其他物種的種群在繁殖上是隔離的, 物種在自然界中占據特定的生態位[2]。生態學研究認為, 具有完全相同的生態位的兩個物種無法共存, 同域分布的物種通過占據不同的生態位實現共存[3—6]。傳統的分類學采用形態特征來識別物種, 但是, 由于物種形態特征的趨同進化, 有些隱存種在從形態上難以識別[7,8]。于是, 分子分類研究開始嘗試選擇不同的分子標記, 利用一定的DNA序列差異作為標準以達到區分不同物種的目的[9—11]。

馬口魚(Opsariichthys bidensGünther)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae), 是東亞特有的一種小型魚類, 在中國的各大水系的支流中均有分布, 多棲息于底質為砂石的小溪或江河支流中。楊干榮等[12]根據側線鱗的數量將分布于中國的馬口魚分為黑龍江亞種和南方亞種。陳宜瑜[13]發現不同水系馬口魚的側線鱗數目及數量呈現出自北向南遞減的現象, 認為不能根據側線鱗數目的變異去劃出地域上的差異, 分布于東亞大陸的馬口魚應為一個種。形態學分析結果表明不同水系的馬口魚并沒有形態上的差異, 只有側線鱗數和背鰭前鱗數呈現自北向南遞減的現象, 因此, 形態學研究趨向于認為中國大陸的馬口魚是一個處于分化中的種[14]。

近年來, 越來越多地研究者開始運用分子標記開展魚類的隱存種研究[15—18]。與此同時, 馬口魚的分子生物學研究也取得了一些進展, 從而使魚類研究者對馬口魚類的物種多樣性及其隱存種現象有了新的認識。基于細胞色素b(Cytb)基因, Perdice等[19]對中國珠江、長江和海河水系的馬口魚的系統發育分析發現了五個譜系, 這些譜系間的遺傳差異已經達到了種間水平, 可能為五個不同的種。針對Perdice五個譜系中的三個譜系, Johansson[20]用框架法進行了形態學的補充研究, 結果表明這三個譜系在形態上存在差異。Perdices[21]對長江和珠江馬口魚的分析結果表明, 這兩個水系的馬口魚可能為三個種。李高巖等[22]基于Cytb基因序列分歧發現馬口魚以南嶺為界分為兩大譜系, 認為這兩個譜系可能對應兩個不同的種。

基于線粒體Cytb基因序列, 本研究對采自于伊洛河馬口魚遺傳多樣性進行分析, 構建的系統樹呈現出兩個支持率較高(100%)的分支, 分支間的遺傳距離達到了3.1%。參照DNA條形碼廣泛采用的3%閾值的物種識別標準[9,11], 這兩個分支可能代表不同的物種。因此, 本研究對伊洛河的馬口魚進行了進一步的微衛星和穩定同位素分析, 以檢測這兩個分支間是否發生了生殖隔離和營養生態位的分離。本研究的目的是為了明確伊洛河馬口魚兩個分支的遺傳差異是屬于同一物種的分化還是不同物種的分化。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及總DNA的提取

在黃河支流伊洛河的4個地點(圖 1), 我們共采集到48尾形態完整的馬口魚樣品, 樣品的鑒定參照鯉科魚類志[12]。采集的樣品利用95%的酒精保存,用于后續DNA的提取及穩定同位素的分析。DNA提取采用標準的高鹽法[23]。利用1%的瓊脂糖電泳檢測提取的DNA質量。

1.2 細胞色素b基因序列擴增及數據分析

Cytb基因的PCR擴增體系總體積為30 μL, 包括雙蒸水20.25 μL, 10×PCR 緩沖液 (含 MgCl2) 3.0 μL,正反向引物各1 μL (10 mmol/L), dNTPs (2.5 mmol/L each) 1.5 μL,Taq酶(2.5 U/mL, TaKaRa Bio) 0.25 μL,DNA模板3 μL。PCR擴增條件為94℃預變性5min,94℃ 變性30s, 53℃退火30s, 72℃ 延伸70s, 擴增30個循環, 72℃終延伸5min。用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物, 純化后的PCR產物用于測序。擴增引物使用通用引物(L14724: 5′-GACTTG AAAAACCACCGTTG-3′, H15915:5′-CTCCG ATCTCCGGATTACAAGAC-3′)以及根據馬口魚線粒體基因組設計的特定引物(F3: 5′-CGGA TTTTAACCGAGACCA-3′, R3: 5′-TCGGAT TACAAGACCGATG-3′)。

用SeqMan (DNASTAR Inc.)查看測序峰圖, 對序列進行手工校正。利用MEGA7.0[24]進行遺傳距離的計算與鄰接樹(Neighbor-Joining, NJ)構建, 采用P-distance模型, 進行了1000次自展分析驗證樹的節點的可靠性。貝葉斯分析利用MrBayes v.3.1.2[25]軟件進行, 馬爾可夫鏈的蒙特卡羅方法設置為4條馬爾可夫鏈, 包括3條熱鏈和1條冷鏈; 計算代數為2×107代, 每1000代對系統樹進行抽樣, 舍棄前面的5000棵樹(25%), 剩余的樹的用來產生一棵一致樹。用DnaSP5[26]進行單倍型分析。

圖 1 樣品采集地點Fig. 1 Sampling sites and population names of O. bidens from the Yiluo River

1.3 微衛星(SSR)多態性分析

根據寬鰭鱲(Zacco platypus)的微衛星引物(引物未發表), 篩選能夠特異性擴增且具有多態性的微衛星引物。SSR擴增體系總體積為20 μL, 包括雙蒸水8 μL, 2×TaqMaster Mix (VaZyme) 10 μL,正反向引物各0.5 μL (10 mmol/L), DNA模板1 μL。PCR擴增條件為94℃預變性5min, 94℃ 變性30s,53℃退火30s, 72℃ 延伸1min, 擴增32個循環, 72℃終延伸5min。擴增產物用1%的瓊脂糖電泳檢測后送到商業公司檢測擴增片段大小, 用GeneMarker軟件對微衛星進行等位基因分型。用Excel對原始數據進行統計, 用Convert[27]進行數據格式轉換, 轉換后的數據用microchecker[28]檢測是否有異常值及無效等位基因的存在。用Genepop[29]檢測每個位點是否偏離哈溫平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium,HWE)以及位點間是否存在連鎖不平衡(Linkage disequilibrium, LD)。用Arlequin3.0[30]檢測兩個分支間的遺傳分化情況。群體固定系數Fst用來評估兩個譜系的遺傳分化程度[31]。基于基因型數據用Population1.2.32[32]計算兩兩個體間的遺傳距離并構建NJ樹(Bootstraps=1000)。

1.4 穩定同位素分析

我們將伊洛河馬口魚的兩個分支分別定義為Clade A和Clade B, 共測定23個樣品, 其中Clade A 14個樣品, Clade B 9個樣品。每個樣品剪取適量的肌肉, 70℃烘干至恒重。用研缽研磨成均勻的粉末后密封保存。穩定同位素碳的含量在本實驗室的DELTA VADVANTAGE (ThermoFisher Scientific)元素分析儀上測定, 儀器測量精度為±0.347‰(SD)。穩定同位素由δX表示,X的計算公式為X=1000[(Rsample/Rstandard-1)], 其中X代表13C 或15N,Rsample為13C/12C 或15N /14N的值。碳、氮穩定同位素的標準物質分別為 VPDB(美洲擬箭石)和 N2(氮氣), 為保證原始數據的可靠性, 每隔5個樣品放一個標樣。穩定同位素碳和氮的量分別用δ13C和δ15N表示, 根據標準物質的測量值對原始數據進行校正后, 用SPSS檢測δ13C 和δ15N在兩個譜系間是否存在差異。分別以δ13C和δ15N為橫縱坐標, 以包含δ13C-δ15N 二維空間的凸多邊形總面積(TA, Total Area of convex hull)來表示種群或物種的營養生態位寬幅,以通過貝葉斯理論修正后的標準橢圓面積(SEAc,Standard Ellipse Area)來表示物種的核心生態位, 用R軟件包中的SIAR及SIBER軟件包分析馬口魚的兩個分支的生態位的重疊情況[33,34]。

圖 2 基于貝葉斯推論和鄰接法構建的馬口魚的系統發育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of O. bidens using the Neighbor-joining Bayesian inference methods

2 結果

2.1 Cyt b基因序列變異

本研究成功獲得48條Cytb基因DNA序列, 序列長度為1140 bp, 沒有插入、缺失以及提前終止的情況。DNA序列的平均堿基組成分別為T=29.4%,C=29.8%, A=23.9%, G=16.9%。序列排列位點中包含了48個可變位點, 13個單倍型(數據未展示)。以海南馬口(Opsariichthys hainanensis, KJ940933)和寬鰭鱲(Z. platypus, KF408383)為外類群, 構建的BI樹和NJ樹的拓撲結構一致, 伊洛河馬口魚聚為兩個分支(圖 2), 支持率為100%。馬口魚的兩個分支間不存在共享單倍型(數據未展示), 兩個分支均包含了來自于所有采樣點的樣本。伊洛河馬口魚分支間的遺傳距離為3.1%, 分支內個體間的平均遺傳距離為0.2%。

2.2 微衛星與遺傳分化

在寬鰭鱲的微衛星引物中, 篩選到了11對能特異性擴增且具有多態性的引物(表 1)。根據NJ樹把樣品分為兩個群體, 分別命名為Clade A(38個個體)及Clade B(10個個體)。兩個群體間的11個微衛星位點均未檢測到雜合子缺失和無效等位基因, 也不存在偏離哈溫平衡的情況, 位點間不存在連鎖不平衡。

通過微衛星標記檢測兩個群體是否發生了遺傳分化。ANOVA分析結果顯示, 只有0.12%的遺傳差異來自兩個群體間, 99.88%的遺傳差異來自個體, 兩個分支間并沒有發生顯著的遺傳分化(Fst=0.0012,P=1)。為了更清楚地了解種群間個體的關系, 根據個體間的DAS距離構建個體間的關系樹,得到的無根樹分為兩個支, 兩個分支分別包含了34和14個個體(圖 3), 黑色標記的個體來自由Cytb構建的系統發育樹的Clade A, 紅色標記的個體來自Clade B。

2.3 營養生態位

兩個分支的穩定同位素碳(δ13C)和氮(δ15N)的測量數值見表 2, 穩定同位素碳(δ13C)和氮(δ15N)的量在兩個譜系間均沒有顯著差異, 表明Clade A和Clade B在食物選擇上沒有差異。

表 1 微衛星擴增引物信息Tab. 1 SSR primers used in this experiment

圖 3 由個體間的DAS距離構建個體間的關系樹Fig. 3 The Neighbor-joining dendrogram of O. bidens constructed using the distance of DAS from 11 microsatellite loci

以包含δ13C-δ15N 的二維空間來表示物種的營養生態位寬幅(TA)和核心生態位(SEA), 結果顯示,兩個群體沒有營養生態位的分離, Clade A和Clade B的TA分別為12.342、10.028, SEAc分別為5.041、6.429。Clade A和Clade B的SEAc的重疊面積為4.061, 分別占兩個群體的核心生態位的80.3%和63.2%(圖 4)。

表 2 穩定同位素的含量及兩獨立樣本Mann-Whitney U 檢驗分析結果Tab. 2 Values of δ13C and δ15N and results of independent-samples Mann-Whitney U test

3 討論

物種鑒定的分子標記通常要求物種間需呈現出較高的遺傳差異, 但種內則為較低變異, 而且差異需要達到一定的標準[11,16]?；贑ytb基因序列,伊洛河流域馬口魚的兩個分支的遺傳差異可達3.1%。參考DNA條形碼的標準, 伊洛河流域馬口魚兩個分支之間的遺傳差異達到了物種的水平。然而, 以微衛星為標記的種群遺傳分析顯示, 分支間的差異僅為總差異的0.12%, 而個體間的差異占了總差異的99.88%, 說明遺傳差異主要來自個體間。Clade A和Clade B可能來自同一個祖先群體, 它們不存在種群遺傳分化。利用微衛星標記計算的無根樹也不能與Cytb的系統樹相對應, 說明兩個分支之間不存在繁殖隔離。同一物種的個體間存在較大的遺傳差異, 其原因可能是祖先種群存在遺傳差異[35—37]。

同域共存的不同物種之間應存在食物的競爭,它們通過利用不同的空間或采取不同的攝食策略占據不同的生態位[4,38,39]。穩定同位素可反映物種的食物來源和營養生態位, 碳值(δ13C)范圍表示物種的食物來源的范圍, 氮值(δ15N)范圍表示物種的營養級位置[40—43]。本研究中, 以δ13C和δ15N表示的馬口魚的兩個分支之間的營養生態位沒有發生分離, 這可能是因為其棲息地及食物選擇沒有差異[22]。

綜上所述, 基于Cytb基因伊洛河馬口魚的兩個分支遺傳分歧達到了種間水平, 但種群間不存在生殖隔離, 營養生態位也沒有分離。這一結果并不符合隱存種的解釋, 伊洛河兩個分支間線粒體DNA的遺傳差異可能源自于祖先種群的多態性[35—37]或者種間雜交[43—45]。此外, 中國馬口魚的物種多樣性較為復雜, 形態學上并未發現顯著差異[14], 其隱存種研究尚未取得一致的結果[13,20,46]。因此, 馬口魚隱存種問題的最終澄清還有待于研究者的進一步的系統深入研究。

圖 4 馬口魚的兩個分支的生態位寬幅(TA)及核心生態位(SEAc)Fig. 4 Trophic niche of O. bidens from the two clades