鱖對(duì)葡萄糖和糊精利用差異比較研究

任 萍 梁旭方 方 劉 何 珊 肖倩倩 史登勇

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)鱖魚研究中心, 武漢 430070; 2. 農(nóng)業(yè)部鱖魚育種創(chuàng)新基地, 農(nóng)業(yè)部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070; 3. 長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院, 荊州 434025; 4. 湖北省水產(chǎn)良種試驗(yàn)站, 武漢 430070)

糖作為魚類經(jīng)濟(jì)高效的能量來源之一, 飼料中提供足夠多的碳水化合物可以減少蛋白質(zhì)的分解供能, 增加蛋白質(zhì)的保留率[1,2]。大多數(shù)魚類可以通過增加飲食中脂質(zhì)和碳水化合物的比例來提高蛋白質(zhì)利用效率[3,4]。然而, 飼料中過多的碳水化合物會(huì)加重魚體負(fù)擔(dān), 魚體會(huì)將多余的碳水化合物排出體外從而造成浪費(fèi)。魚類利用糖的能力存在物種差異[5,6], 肉食性魚類對(duì)碳水化合物的利用能力低于雜食性和草食性魚類。在不減少魚類生長(zhǎng)的情況下, 黃尾魚(Caranx malam)飼料中最大糊精添加水平是10%, 紅鯛(Pagrus major)是20%, 而鯉(Cyprinus carpio)是30%[7]。大多數(shù)肉食性魚類表現(xiàn)出糖不耐受[8—10], 葡萄糖攝入后出現(xiàn)持續(xù)高血糖現(xiàn)象[11—13]。然而, 肉食性魚類不能高效利用碳水化合物的分子機(jī)制尚不清楚。魚類對(duì)不同形式碳水化合物的利用能力亦存在差異, 對(duì)多糖和寡糖的利用要好于單糖和二糖[14—17], 這可能與糖分子的結(jié)構(gòu)有關(guān)[18—20]。葡萄糖是自然界分布最廣的單糖, 糊精是-型多糖, 已有研究表明白鱘(Acipenser transm ontanus)[21]、鯰(Ictalurus punctatus)[9]、鯉[22]、羅非魚(Oreochromis niloticus×O. aureus)[23]對(duì)糊精的利用比葡萄糖好。因此, 魚類對(duì)不同形式糖類利用差異的原因有待進(jìn)一步研究。

鱖(Siniperca chuatsi)是典型的肉食性魚類, 在自然條件下以活魚蝦為食, 梁旭方團(tuán)隊(duì)研究了鱖馴食機(jī)理, 經(jīng)馴化后可接受人工飼料, 是研究肉食性魚類碳水化合物利用機(jī)制的優(yōu)良模型[24—26]。灌喂方法對(duì)魚的刺激性小, 可以準(zhǔn)確反映魚對(duì)糖的耐受性[27], 據(jù)報(bào)道, 研究魚類對(duì)碳水化合物的利用能力可以用灌喂方法[11,13,28]。本研究采用灌喂法比較研究鱖對(duì)葡萄糖和糊精的代謝差異, 檢測(cè)尿糖、血糖、血胰島素、血甘油三酯、肝糖原和肌糖原含量及糖代謝相關(guān)基因表達(dá)水平。通過比較肉食性魚類對(duì)不同碳水化合物的利用差異, 有助于更好地了解肉食性魚類對(duì)碳水化合物利用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚及養(yǎng)殖條件

本試驗(yàn)中使用的鱖購(gòu)自湖北省麻城市浮橋河水庫(kù)。試驗(yàn)開始前, 將64尾鱖(200±5) g 放在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)殖基地350 L魚缸中, 進(jìn)行為期4周的暫養(yǎng)。在此期間, 每天根據(jù)鱖體重的3%—5%投喂麥鯪(Cirrhinus mrigala)。水溫維持在(25±1)℃, pH 7.11—7.59, 溶氧為7.26—7.86 mg/L, 氨氮及亞硝酸鹽＜0.1 mg/L。

1.2 灌喂碳水化合物和樣品采集

在試驗(yàn)開始前, 將鱖分成兩組, 禁食24h, 并用200 mg/L MS-222麻醉。使用裝有塑料管的注射器以1670 mg/kg[11,22,29]劑量灌喂葡萄糖或糊精, 將魚放回原來的養(yǎng)殖魚缸中, 灌喂參照文獻(xiàn)報(bào)道方法[11]。兩組均灌喂32尾鱖, 灌喂后于0、1h、2h、3h、4h、8h、12h和24h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組均取4尾鱖并尾靜脈抽血, 并收集水樣, 室溫下, 4500×g離心5min以分離血漿。解剖魚體, 取0.2 g的肌肉和肝臟于液氮中速凍并保存在-80℃。通過葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法測(cè)量血糖及水體中糖含量(尿糖含量)。通過堿消化法測(cè)量肝糖原和肌糖原含量。通過酶比色法測(cè)量甘油三酯含量。通過酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血胰島素。試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 相關(guān)基因表達(dá)水平檢測(cè)

根據(jù)Promega公司提供的RNA提取說明書提取組織RNA, 并通過多功能酶標(biāo)儀(BioTek)檢測(cè)2 L RNA濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄酶(購(gòu)自Takara公司)將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。核糖體蛋白L13a (Ribosomal protein L13a,rpl13a)作為內(nèi)參基因, 采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR的方法檢測(cè)鱖肝臟中的葡萄糖激酶(Glucokinase,GK)、脂肪酸合成酶(Fatty Acid Synthetase,FAS)、乙酰輔酶A羧化酶Ⅰ型(Acetyl-CoA Carboxylase Type Ⅰ,ACC1)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate Carboxykinase,PEPCK)、糖原合酶(Glycogen Synthase,GS)、檸檬酸合成酶(Citroyl synthetase,CS)以及鱖肌肉中的糖原合酶(Glycogen Synthase,GS)基因的相對(duì)表達(dá)水平。Real Time PCR擴(kuò)增反應(yīng)反應(yīng)體系為: 10 μL AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix(諾唯贊, 南京)、1 μL cDNA、0.4 μL Forward Primer(10 mmol/L)、0.4 μL Reverse Primer(10 mmol/L)、8.2 μL ddH2O。反應(yīng)液的配制在冰上進(jìn)行, 反應(yīng)程序?yàn)?95℃, 30s; 95℃, 5s; 40×cycles; 58℃, 30s; 72℃, 30s;溶解曲線: 65—95℃, 每上升0.5℃ 停留5s。使用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物, 引物序列[30]示于表 1中。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置4個(gè)生物學(xué)重復(fù), 并為每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 18.0軟件(SPSS, 美國(guó)芝加哥)評(píng)估數(shù)據(jù)的正態(tài)性, 同一時(shí)間點(diǎn)不同組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn), 同一組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)來判斷平均值間的顯著性。通過2-ΔΔCt分析獲得基因的相對(duì)表達(dá)水平, 結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示,P＜0.05表示差異顯著。

表 1 本研究實(shí)時(shí)定量PCR引物Tab. 1 Primers used for real-time PCR used in this study

2 結(jié)果

2.1 灌喂不同碳水化合物對(duì)鱖尿糖及血糖的影響

鱖經(jīng)灌喂葡萄糖后尿糖含量在1—12h內(nèi)迅速增加且各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于灌喂前水平, 在8h達(dá)到最大值是0.467 mg/(kg·h), 隨后開始下降, 并在24h時(shí)降至灌喂前水平且含量是0.101 mg/(kg·h), 而灌喂糊精組鱖尿糖含量?jī)H在灌喂后8h顯著高于其他各個(gè)時(shí)間點(diǎn)及灌喂前水平, 表明鱖對(duì)不同碳水化合物表現(xiàn)出不同的尿糖情況。此外, 灌喂葡萄糖組的鱖尿糖含量在1h、2h、3h、4h、8h和12h時(shí)極顯著高于糊精組(P＜0.01, 圖 1A), 葡萄糖組鱖血糖含量先升高再降低, 在2h時(shí)達(dá)到最大值, 在24h降至最小值, 血糖值在2h和24h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)有顯著差異(P＜0.05), 但與灌喂前水平相比, 無顯著差異。灌喂糊精組鱖血糖含量在24h內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無顯著差異(P＞0.05, 圖 1B)。然而, 在灌喂后24h內(nèi)每個(gè)時(shí)間點(diǎn), 兩組之間血糖水平?jīng)]有顯著差異(P＞0.05, 圖 1B)。

2.2 灌喂不同碳水化合物對(duì)鱖血胰島素、血甘油三酯、肝糖原及肌糖原的影響

灌喂不同碳水化合物后, 鱖血胰島素變化趨勢(shì)一致。葡萄糖組和糊精組鱖在灌喂后24h內(nèi), 血胰島素在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間均無顯著差異(P＞0.05), 在24h內(nèi)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組鱖血胰島素含量相比, 均無顯著差異(P＞0.05, 圖 2A)。此外, 兩組鱖血甘油三酯含量變化趨勢(shì)相似, 均是先升高再降低。兩組鱖均在灌喂后2 h達(dá)到最大值且顯著高于灌喂前水平(P＜0.05), 但與其他各個(gè)時(shí)間點(diǎn)相比, 無顯著差異(P＞0.05), 2h以外的其它時(shí)間點(diǎn)與灌喂前水平相比無顯著差異(P＞0.05, 圖 2B)。

在灌喂不同碳水化合物后24h內(nèi), 兩組肝糖原含量先增加后減少。葡萄糖組的肝糖原含量在灌喂后1—12h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于灌喂前水平,4h時(shí)達(dá)最大值42.43 mg/g, 24h時(shí)降至灌喂前水平(P＜0.05, 圖 2C)。而糊精組鱖肝糖原含量在8h時(shí)達(dá)最大值(58.61 mg/g)并顯著高于4h時(shí)的肝糖原含量(P＜0.05), 但4h和8h時(shí)肝糖原含量各自與各個(gè)時(shí)間點(diǎn)相比, 無顯著差異, 且灌喂后24h內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于灌喂前水平, 在1h時(shí), 葡萄糖組肝糖原含量顯著低于糊精組(P＜0.05, 圖 2C)。此外, 葡萄糖組肌糖原含量變化緩慢, 24h時(shí)顯著高于灌喂前水平及灌喂后的1—4h (P＜0.05, 圖 2D)。糊精組肌糖原含量在灌喂后1—24h內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于灌喂前水平(P＜0.05, 圖 2D), 但各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間均無顯著差異(P＞0.05)。在灌喂后24h內(nèi)的每個(gè)時(shí)間點(diǎn), 葡萄糖組的肌糖原含量顯著低于糊精組(P＜0.05,圖 2D)。

圖 1 灌喂不同碳水化合物對(duì)鱖尿糖及血糖含量的影響Fig. 1 Effects of the oral administration of different carbohydrates on the urine glucose and plasma glucose concentrations in Chinese perch

2.3 灌喂不同碳水化合物對(duì)鱖糖脂代謝相關(guān)基因的影響

鱖經(jīng)灌喂不同碳水化合物后, 糖脂代謝相關(guān)基因表達(dá)水平變化趨勢(shì)相似, 均是先升高后降低。葡萄糖組GK(葡萄糖激酶)基因相對(duì)表達(dá)水平在4h時(shí)達(dá)到最大值, 顯著高于灌喂前水平及灌喂后其他各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(P＜0.05), 而糊精組GK基因相對(duì)表達(dá)水平在8h時(shí)達(dá)到最大值, 顯著高于灌喂前水平及灌喂后1h、2h、3h、12h和24h時(shí)GK基因相對(duì)表達(dá)值(P＜0.05, 圖 3A)。兩組鱖FAS(脂肪酸合成酶)基因相對(duì)表達(dá)量在24h內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無顯著差異(P＞0.05, 圖 3B)。葡萄糖組鱖ACC1(乙酰輔酶A羧化酶Ⅰ型)基因相對(duì)表達(dá)值在12h時(shí)顯著高于灌喂前水平及1h和2h (P＜0.05), 糊精組鱖ACC1基因相對(duì)表達(dá)值在4h和24h顯著高于灌喂前水平(P＜0.05,圖 3C)。葡萄糖組PEPCK(磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶)基因相對(duì)表達(dá)值在12h和24h時(shí)顯著高于灌喂后1h、2h和3h (P＜0.05, 圖 3D), 卻與灌喂前水平無顯著差異, 而糊精組PEPCK基因相對(duì)表達(dá)值在24h內(nèi)無顯著差異(P＞0.05, 圖 3D)。葡萄糖組GS(糖原合酶)在8h時(shí)顯著高于灌喂前水平及24h內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(P＜0.05), 而糊精組GS在4h和12h時(shí)顯著高于灌喂前水平及1h和3h (P＜0.05, 圖 3E)。葡萄糖組中CS(檸檬酸合成酶)基因表達(dá)水平在4h時(shí)顯著高于灌喂前水平及其1h、2h和3h (P＜0.05),CS最大值在8h時(shí)出現(xiàn), 且顯著高于灌喂前水平及24h內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn), 而糊精組CS在24h內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)無顯著差異(P＞0.05, 圖 3F)。此外, 不同碳水化合物灌喂鱖1h時(shí), 葡萄糖組中GK、FAS和ACC1相對(duì)基因表達(dá)水平顯著低于糊精組(P＜0.05)。然而, 兩個(gè)組PEPCK基因表達(dá)水平在灌喂后24h內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無顯著差異(P＞0.05)。在灌喂后8h時(shí), 葡萄糖組中GS基因表達(dá)量顯著高于糊精組(P＜0.05)。此外, 葡萄糖組中CS基因表達(dá)水平在1h顯著低于糊精組(P＜0.05), 然而, 葡萄糖組中CS在8h和12h顯著高于糊精組(P＜0.05)。

3 討論

與肉食性魚類不同, 草食和雜食性魚類能更好地利用碳水化合物, 表現(xiàn)出較低的餐后血糖和較高的糖耐受能力[8,31]。因此, 本論文研究肉食性魚類鱖對(duì)不同碳水化合物(葡萄糖和糊精)的利用差異。已有研究表明肉食性魚類攝入含糖食物后血糖水平持續(xù)升高[22], 鯉的血糖恢復(fù)到攝食前水平需要5h[10], 草魚需要10h[28]。然而, 本研究發(fā)現(xiàn)鱖經(jīng)灌喂葡萄糖后3h時(shí)已降至灌喂前水平, 而糊精組鱖血糖水平在灌喂后24h內(nèi)未發(fā)生較大波動(dòng)(圖 1B)。葡萄糖屬于單糖, 易于吸收, 鱖經(jīng)灌喂葡萄糖后, 血糖含量迅速升高, 3h時(shí)已降至灌喂前水平, 表明葡萄糖組鱖降低高血糖的能力較強(qiáng), 這與石斑魚對(duì)高血糖的應(yīng)答情況相似[29]。而糊精組鱖攝入糖后不會(huì)改變血糖水平, 推測(cè)糖主要以其他形式進(jìn)行代謝。參與維持鱖恒定血糖水平的途徑可能包括糖代謝相關(guān)酶活性及基因表達(dá)、胰島素內(nèi)分泌調(diào)控等[32,33]。

胰島素作為一種多功能肽激素, 可促進(jìn)糖的利用和轉(zhuǎn)化, 抑制糖異生和降低血糖水平[34]。攝入糖后, 大鱗大馬哈魚(Oncorhynchus tshawytscha)[10]和石斑魚(Epinphelus coioides)血胰島素水平下降, 血糖水平升高。與恒定血糖水平相適應(yīng), 本研究發(fā)現(xiàn)血胰島素水平在灌喂葡萄糖或糊精后24h內(nèi)亦未發(fā)生變化(圖 2A), 歐洲海鱸(Dicentrarchus labrax)中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果[35]。

圖 2 灌喂不同碳水化合物對(duì)鱖血胰島素、血甘油三酯、肝糖原及肌糖原含量的影響Fig. 2 Effects of the oral administration of different carbohydrates on insulin, triglycerides, hepatic glycogen and muscle glycogen in Chinese perch

灌喂葡萄糖后鱖尿糖水平顯著高于糊精組(圖 1A),且葡萄糖組鱖在灌喂后1—12h內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于灌喂前水平, 表明鱖攝入的葡萄糖會(huì)通過尿排出體外, 而攝入糊精后通過尿排出較少。考慮到碳水化合物其他代謝途徑, 本研究也檢測(cè)了肝糖原和肌糖原含量。肝臟和肌肉是葡萄糖以糖原形式儲(chǔ)存在體內(nèi)的兩個(gè)主要器官, 大量研究表明魚類攝入糖后肝糖原和肌糖原水平顯著升高[8,27]。本研究發(fā)現(xiàn), 葡萄糖組鱖肝糖原含量在灌喂后1—12h內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于灌喂前水平, 而糊精組鱖肝糖原含量在灌喂后1—24h內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于灌喂前水平, 在1h時(shí)葡萄糖組肝糖原水平顯著低于糊精組, 其他時(shí)間點(diǎn)沒有顯著差異(圖 2C)。葡萄糖組鱖肌糖原含量在灌喂后24h時(shí)均顯著高于各個(gè)時(shí)間點(diǎn), 而糊精組鱖肌糖原含量在灌喂后1—24h內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于灌喂前水平, 葡萄糖組肌糖原含量在24h內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著低于糊精組(圖 2D)。以上結(jié)果表明, 在鱖攝入葡萄糖或糊精后, 可轉(zhuǎn)化為肝糖原和肌糖原存儲(chǔ)在體內(nèi), 且糊精的轉(zhuǎn)化能力優(yōu)于葡萄糖, 而不是主要以尿糖的形式排出體外。

圖 3 灌喂不同碳水化合物對(duì)鱖GK、FAS、ACC1、PEPCK、GS和CS基因表達(dá)水平的影響Fig. 3 The mRNA expression levels of GK, FAS, ACC1, PEPCK, GS and CS in Chinese perch after the oral administration of two different carbohydrates

已有研究表明魚類中糖代謝關(guān)鍵酶類基因表達(dá)水平受攝食糖水平的影響[36]。糖原合酶(GS)是糖原合成中的關(guān)鍵酶, 在肝糖原和肌糖原合成中起重要作用[37]。本研究中, 鱖灌喂葡萄糖8h后, 糖原合酶基因表達(dá)水平顯著高于灌喂糊精組(圖 3E)這進(jìn)一步解釋糖原合成增多的原因。葡萄糖激酶(GK)是糖酵解過程中的關(guān)鍵酶, 有效催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸, 這是糖酵解過程的第一步[38]。本研究中灌喂葡萄糖1h后,GK基因表達(dá)水平顯著低于糊精組(圖 3A), 表明鱖對(duì)葡萄糖的分解利用好于糊精。檸檬酸合成酶(CS)是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵限速酶, 葡萄糖組CS基因表達(dá)水平在灌喂1h時(shí)顯著低于糊精組, 灌喂8h和12h時(shí)卻顯著高于糊精組(圖 3F)。磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PEPCK)是糖異生過程中的關(guān)鍵酶, 鱖灌喂兩種不同形式碳水化合物后, 葡萄糖組鱖PEPCK基因表達(dá)水平在12h和24h時(shí)顯著高于灌喂前水平, 而糊精組PEPCK基因表達(dá)水平并未表現(xiàn)出差異(圖 3D), 表明葡萄糖對(duì)鱖糖異生的作用優(yōu)于糊精。這與錦鯉(Cyprinus carpio)和紅鯛中的研究結(jié)果相似[15]。以上結(jié)果表明,鱖可以很好地利用葡萄糖和糊精, 并轉(zhuǎn)化為肝糖原和肌糖原存儲(chǔ)下來, 葡萄糖可以加速鱖體內(nèi)糖酵解進(jìn)而糖異生過程, 且作用優(yōu)于糊精。

在糖進(jìn)入體內(nèi)后, 不僅可以分解利用, 還可與脂代謝發(fā)生聯(lián)系, 轉(zhuǎn)化為脂肪。因此, 本研究檢測(cè)了鱖經(jīng)灌喂不同碳水化合物后血甘油三酯水平, 發(fā)現(xiàn)灌喂葡萄糖和糊精均可促進(jìn)血甘油三酯合成(圖 2B),且葡萄糖的促進(jìn)作用低于糊精。歐洲鱸[39]、白鱘(Acipenser transm ontanus)[12]和異育銀鯽(Carassiusauralus gibelio)[40]的研究中亦發(fā)現(xiàn)相同結(jié)果, 糖攝入可促進(jìn)脂肪的生成。脂肪酸合成酶(FAS)和乙酰輔酶A羧化酶I型(ACC1)是脂肪酸合成過程中關(guān)鍵的催化酶, 葡萄糖組FAS和ACC1基因表達(dá)水平在灌喂后1h時(shí)顯著低于糊精組(圖 3B和圖 3C), 因此, 葡萄糖和糊精的攝入可以有效激活脂肪酸合成代謝,促進(jìn)糖轉(zhuǎn)化為脂肪, 而減少未利用糖以尿糖形式排出, 且葡萄糖的促進(jìn)作用低于糊精。

綜上所述, 肉食性魚類鱖對(duì)不同形式碳水化合物表現(xiàn)出不同的代謝效率, 攝入糖后可以促進(jìn)糖原和脂肪的合成, 轉(zhuǎn)化為糖原和甘油三酯, 從而減少未利用糖的排出, 且鱖對(duì)葡萄糖的利用低于糊精。本論文為比較研究不同食性魚類糖代謝利用的分子機(jī)制, 提供了理論依據(jù)。