皮膚惡性黑色素瘤患者Cx43表達水平及預后影響因素分析

王峻嶺 李 慧 張冀北 張 麗 劉芳芳

皮膚惡性黑色素瘤是一種惡性程度較高的惡性腫瘤，近年來發病率呈明顯升高趨勢，年增長率約為3%～5%[1]；手術切除是其首選的治療方法，但患者術后生存狀況普遍不樂觀，此病的發病機制目前仍未完全闡明。縫隙連接蛋白(connexin，Cx)是一種跨膜蛋白家族，目前該家族在人類體內共發現有20余個成員，其中Cx43最常見，并在體內廣泛表達，主要參與細胞的縫隙連接通訊，近年來發現其與多個惡性腫瘤的發生、發展密切相關[2-3]。有體外研究[4-5]表明Cx43在皮膚惡性黑色素瘤中可能作為腫瘤抑制因子，過表達野生型Cx43能明顯增強小鼠黑色素瘤細胞的縫隙連接通訊功能，而過表達突變型Cx43則能減弱該功能，但國內尚未見Cx43在皮膚惡性黑色素瘤患者體內研究的報道。本研究檢測56例皮膚惡性黑色素瘤患者的癌組織與癌旁組織Cx43表達水平，旨在探討影響患者預后的因素，為臨床預后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月至2016年12月河北省滄州市中心醫院收治的56例皮膚惡性黑色素瘤患者為研究對象，其中男35例，女21例，年齡35～75歲，平均(55.75±5.33)歲。納入標準：①首次發病，入院后均行手術治療，病理結果確診為皮膚惡性黑色素瘤；②預期壽命超過3個月；③術前未接受任何抗腫瘤治療；④臨床及病理資料完整。排除標準：①年齡>75歲；②合并其他惡性腫瘤或心、肝、肺、腎等臟器嚴重疾病。

1.2 方法 檢測并比較患者癌組織與癌旁組織的Cx43表達水平，以全部患者癌組織Cx43表達水平的中位數0.85為臨界值，將患者分為低表達組和高表達組，各28例。收集患者病例資料，比較兩組臨床病理特征和生存狀況，采用多因素Cox回歸模型分析患者預后的影響因素。

1.2.1 Cx43表達水平的檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)方法檢測所有患者癌組織和癌旁組織的Cx43表達水平：術中取直徑約10 mm的組織樣本，放至-80℃冰箱保存，采用專門的RNA 提取試劑盒(北京天根生物公司)提取組織的總RNA，全部過程嚴格按照說明書進行，用焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水溶解提取的總RNA，采用紫外分光光度計(德國Eppendorf公司)測量RNA的濃度與純度，之后采用專門的逆轉錄試劑盒(上海TaKaRa公司)將RNA逆轉錄為cDNA，反應體系為10 μL，包括模板4 μL、5×Prime Script Buffer 2 μL、DEPC水4 μL，反應條件為：37℃ 5 min→85℃ 5 s→4℃ 10 min。然后采用q-PCR檢測Cx43的表達水平，通過Primer Bank軟件設計相關引物(上海生工生物公司)。Cx43引物序列：上游，5’-TTCAAGCCTACTCAACTGC-3’，下游，5’-CTTCCTTTCGCATCACAT-3’。反應體系為20 μL，包括模板4 μL、TB Green Premix Ex TaqⅡ 2 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、DEPC 水12 μL，反應條件為：95℃ 5 min→95℃ 5 s→60℃ 34 s，循環40次。以GAPDH表達水平為內參，根據2-△△Ct法[6]計算 Cx43的相對表達量。

1.2.2 資料收集 收集并記錄全部患者的病例資料，包括性別、年齡、體質指數(body mass index，BMI)、卡氏評分、發病部位、原發灶的厚度、有無潰瘍、原發灶-淋巴結-遠處轉移(tumor-node-metastasis,TNM)分期、Clark分級、治療方法等。術后通過電話、門診進行定期隨訪，隨訪截止時間為2018年12月30日，以患者死亡為隨訪終點，計算全部患者的總生存時間。

2 結果

2.1 癌組織和癌旁組織Cx43表達比較 全部患者癌組織Cx43的相對表達水平為(0.82±0.31)，低于癌旁組織的(1.00±0.25)，差異有統計學意義(t=2.392，P=0.020)。

2.2 兩組患者臨床病理資料比較 低表達組TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、Clark分級為Ⅴ級的比例高于高表達組，差異有統計學意義(P<0.05)；兩組其他病理資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3 兩組患者生存情況比較 全部患者共隨訪4～48個月，中位生存時間25.3個月，1年、3年生存率分別為87.5%、26.8%。低表達組患者的中位生存時間為17.9個月，低于高表達組的32.6個月，差異有統計學意義(χ2=16.875，P<0.05)。

圖1 兩組患者生存曲線比較

2.3 多因素Cox回歸模型結果 以患者的生存狀況(0=存活，1=死亡)為因變量，相關臨床病理資料為自變量(賦值情況見表2)，采用最優回歸方程篩選變量以進行Cox回歸，結果表明，癌組織Cx43低表達、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、發病部位為非肢端是皮膚惡性黑色素瘤患者預后的獨立影響因素(P<0.05)。見表3。

表1 兩組患者臨床病理資料比較

表2 自變量賦值表

表3 多因素Cox回歸模型結果

3 討論

Cx43是Cx家族中最常見的成員之一，主要功能是參與細胞的縫隙連接通訊，從而介導細胞與細胞之間的信息交流，與乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌等多個惡性腫瘤關系密切[7-9]。從結構上說，Cx43蛋白的C端結構域上有多個結合位點，能與不同的蛋白進行相互作用，故功能較為復雜，甚至具有兩面性，其在多數惡性腫瘤上作為腫瘤抑制因子，能抑制腫瘤細胞的增殖[10-11]。Ismail 等[12]研究表明結腸癌的癌組織中Cx43的表達較癌旁組織顯著下調，癌細胞的Cx43表達水平也明顯降低。Liu等[13]研究表明卵巢癌組織中Cx43的陽性表達率顯著低于正常卵巢組織，且過表達Cx4能減少SKOV3(一種卵巢癌細胞系)的增殖能力與腫瘤形成。但是，近年來有發現其能促進部分腫瘤細胞的侵襲與遷移。Poyet等[14]研究表明膀胱癌組織中Cx43表達升高，其認為Cx過表達 能增強腫瘤細胞之間的縫隙連接活性，從而促進腫瘤細胞的進展。本研究分析了皮膚惡性黑色素瘤患者癌組織和癌旁組織的Cx43表達水平，并進行生存分析，發現了影響患者預后的預測因素，為臨床預后評估提供了參考。

本研究結果顯示，癌組織Cx43的相對表達水平顯著低于癌旁組織(P<0.05)，提示Cx43在皮膚惡性黑色素瘤中可能作為腫瘤抑制因子，與既往體外實驗結果類似[4]。李玢等[5]研究構建了小鼠黑色素瘤細胞(B16)過表達野生型與點突變型Cx43的細胞模型，結果表明過表達野生型Cx43能明顯增強的細胞縫隙連接通訊功能增強，而過表達突變型Cx43則減弱細胞縫隙連接通訊功能。本課題組前期研究[15]表明，Cx43的表達可能與黑色素瘤的侵襲能力與預后有關，Cx43 表達水平越低，腫瘤侵襲能力越強、病情越嚴重，且患者往往預后較差。本研究還發現Cx43低表達組TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、Clark分級為Ⅴ級的比例明顯高于高表達組(P<0.05)。Clark分級是黑色素瘤細胞的浸潤程度評分，Ⅴ級代表已浸潤到皮下組織，病情最為嚴重，提示癌組織Cx43表達水平與腫瘤的分期、浸潤程度有關。本研究全部患者中位生存時間為25.3個月，低表達組患者的中位生存時間更低，僅為17.9個月，顯著低于高表達組的32.6個月(P<0.05)；多因素Cox結果也證實癌組織Cx43表達水平是患者預后的獨立預測因素(P<0.05)，低表達者的死亡風險是高表達者的2.156倍，提示Cx43的表達水平與腫瘤進展程度有關，可作為一個皮膚惡性黑色素瘤患者預后的預測因子，有待進一步研究探討其具體機制。

綜上所述，皮膚惡性黑色素瘤患者的癌組織Cx43表達水平明顯低于癌旁組織，癌組織Cx43呈低水平表達、TNM分期較晚、非肢端發病是影響患者預后的預測因素。本研究亦有不足之處，屬于單中心研究，納入的病例數較少，下一步將繼續擴大樣本量以驗證結論。