白藜蘆醇抑制重組人白細胞介素11促進肺腺癌轉移灶形成實驗研究*

彭 娜，盧美君，康馬飛，劉秀麗，李碧慧，董翠梅

桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤內科(桂林541001)

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，盡管近年來外科手術、放療和藥物治療等治療水平在不斷提高，但肺癌患者的病死率仍居高不下，死亡原因主要是腫瘤轉移。腫瘤轉移是一個復雜的、多步驟的演變過程。腫瘤細胞要完成轉移過程，必須經(jīng)歷從原發(fā)瘤中脫落、進入血管和(或)淋巴管、在循環(huán)中生存、粘附于繼發(fā)器官微血管、滲出血管和(或)淋巴管、進入繼發(fā)器官組織、形成微轉移瘤并誘發(fā)血管發(fā)生，最終形成轉移瘤。

臨床化療過程中，血小板減少是非常常見的毒副反應，目前最常用的升血小板藥物是重組人白細胞介素11(Recombinant human interleukin 11,rhIL-11)。然而，在胃腸癌中的研究顯示，外源性白細胞介素11可使胃癌AGS 和 MKN45細胞遷徙率增加[1]，提示IL-11可能促進腫瘤侵襲和轉移。我們科研團隊的基礎研究也證實，rhIL-11作用于A549細胞后，細胞的遷移和侵襲能力顯著增強[2]。臨床研究提示，rhIL-11可能促進肺癌轉移[3]。那么，有什么藥物能抑制rhIL-11促腫瘤細胞轉移呢？我們以肺腺癌A549細胞為研究對象，通過動物實驗觀察rhIL-11促腫瘤轉移灶形成作用和評價白藜蘆醇的抗腫瘤轉移灶形成作用。

材料與方法

1 細胞培養(yǎng) 將A549細胞從液氮中取出，快速放入37℃水浴鍋中，使凍存液溶解，將溶解后凍存液轉移到含有5 ml培養(yǎng)基的離心管中，室溫1200 rmp 3 min離心收集細胞，棄上清；用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基重懸細胞，輕輕吹打混勻，接種到培養(yǎng)皿中，37℃ 5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。當顯微鏡下觀察貼壁細胞生長80%以上，0.25%胰蛋白酶消化傳代，按1∶3的比例傳代。收集對數(shù)生長的A549細胞，消化并用PBS重懸成1×107/ml的單細胞懸液。

2 動物模型分組及處理

2.1 經(jīng)尾靜脈注射造模：雌性BALB/C裸鼠，18～22 g，裸鼠由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(湘)2016-0002。裸鼠在SPF條件下飼養(yǎng)，給與全價小鼠顆粒飼料，自由采食和飲水。實驗單位使用許可證號：SYXK桂2013-0001。BALB/C裸鼠適應性飼養(yǎng)1周，每組數(shù)量6只，經(jīng)尾靜脈注射肺癌細胞后連續(xù)給藥2周，第6周結束時處死裸鼠，并解剖觀察有無腹腔、胸腔、肺、肝、腎等遠處轉移，拍照并取疑似部位置于4%多聚甲醛中固定，行病理HE染色檢查。

2.2 給藥治療分組：①對照組：于裸鼠后背部皮下注射生理鹽水。②低劑量rhIL-11組：于裸鼠后背部皮下注射rhIL-11[500 μg/(kg·d)]，連用14 d。③高劑量rhIL-11組：于裸鼠后背部皮下注射rhIL-11[750 μg/(kg·d)]，連用14 d。④低劑量rhIL-11+白藜蘆醇組：于裸鼠后背部皮下注射rhIL-11[500 μg/(kg·d)]+白藜蘆醇[10 mg/(kg·d)，灌胃](同時給藥，兩藥均使用14 d)。⑤高劑量rhIL-11+白藜蘆醇組：于裸鼠后背部皮下注射rhIL-11[劑量750 μg/(kg·d)]+白藜蘆醇[10 mg/kg·d)，灌胃](同時給藥，兩藥均使用14 d)。

2.3 轉移灶的取材及HE染色：①將各組中可疑的腫瘤轉移灶完整切除，并置于4%多聚甲醛中固定。②將固定好的組織放入包埋盒中，用鉛筆在包埋盒上做好樣本標記，進行手動脫水。75%乙醇4 h，85%乙醇2 h，90%乙醇5 h，95%乙醇1 h，無水乙醇Ⅰ 0.5 h，無水乙醇Ⅱ 0.5 h。③組織透明：無水乙醇：二甲苯(1∶1)10 min，二甲苯Ⅰ 10 min，二甲苯Ⅱ 7 min。④浸蠟：用生物組織脫水機將透明后的組織塊依次經(jīng)3缸石蠟(60℃)進行浸蠟，每次各1 h。⑤包埋:在冰盒上，將浸透蠟的組織放入不銹鋼組織包埋模中，使其包裹在石蠟塊中。⑥切片和展片。⑦脫蠟：將石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ(10 min)-二甲苯Ⅱ(10 min)-無水乙醇Ⅰ(5 min)-無水乙醇Ⅱ(5 min)-95%酒精(3 min)-90%酒精(3 min)-80%酒精(2 min)-70%酒精(2 min)，然后蒸餾水浸洗2 min。⑧封片：蘇木素染色20 s，自來水沖洗5 min，1%鹽酸酒精分化1 s，水洗返藍10 min，無水乙醇I 5 min，無水乙醇Ⅱ 5 min，二甲苯I 5 min，二甲苯Ⅱ 5 min，風干后中性樹膠封片，鏡檢。

3 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

rhIL-11組[750 μg/(kg·d)組和500 μg/(kg·d)組]出現(xiàn)轉移病灶顯著多于對照組(Fisher精確概率法，P=0.026)。rhIL-11[750 μg/(kg·d)+白藜蘆醇組和500 μg/(kg·d) +白藜蘆醇組]出現(xiàn)轉移病灶顯著少于rhIL-11[750 μg/(kg·d)組和500 μg/(kg·d)組](χ2=4.216，P=0.040)。見表1、圖1。

表1不同濃度rhIL-11對A549細胞遠處轉移的影響及白藜蘆醇的干預效果(n=6)

討 論

研究認為，IL-11可以促進腫瘤的生長和轉移，IL-11高表達是惡性腫瘤患者預后不良的獨立預測因子[4-6]。研究認為IL-11受體(IL-11R)是腫瘤轉移決定因素[7]。本研究顯示，與對照組相比，使用rhIL-11的裸鼠出現(xiàn)腫瘤病灶的裸鼠數(shù)量增大，而且隨著rhIL-11劑量增加，出現(xiàn)轉移灶的裸鼠數(shù)量及轉移灶數(shù)量均增大，提示rhIL-11可能有促進腫瘤轉移灶形成作用。雖然使用rhIL-11后出現(xiàn)轉移灶的裸鼠數(shù)量與對照組相比較無統(tǒng)計學差異，但絕對數(shù)有較大差別，考慮是由于樣本量太小而導致沒有統(tǒng)計學差異，值得加大樣本量進一步研究。

注：圖A、B、C、D、E分別是對照組、rhIL-11[500 μg/(kg·d)]組、rhIL-11[500 μg/(kg·d)]+白藜蘆醇組、rhIL-11[750 μg/(kg·d)]組和rhIL-11[750 μg/(kg·d)]+白藜蘆醇組的腹腔轉移灶;圖F和G是腸轉移灶的HE染色×100和×200光鏡圖;圖H和I是肺轉移灶的HE染色×100和×200光鏡圖

圖1 rhIL-11和白藜蘆醇對肺癌A549細胞遠處轉移的影響

白藜蘆醇(3,5,4’-三羥基-反式二苯乙烯)是一種植物抗氧化劑，存在于紅葡萄中，對各種惡性腫瘤的發(fā)生有抑制作用[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇通過抑制Notch1和PTEN/Akt信號通路誘導和促進caspase依賴性細胞死亡[9]，阻止TNF-β/ TNF-β受體誘導激活NF-κB信號通路和NF-κB調節(jié)基因產物，從而介導多靶點細胞信號通路抗腫瘤[10]。白藜蘆醇具有抑制癌細胞增殖，以及誘導細胞周期阻滯和凋亡的作用[11-12]，白藜蘆醇可能通過調節(jié)BCL-2、 Bax、P53的表達抑制胰腺癌移植瘤的生長[13]。通過誘導凋亡、調節(jié)DNA甲基化和組蛋白修飾協(xié)同抑制癌細胞[14-16]。最近的研究表明，白藜蘆醇可以抑制腫瘤微環(huán)境應激(如缺氧、氧化應激和炎癥)引起的腫瘤細胞的惡性表型[17-19]，抑制血管生成[20]。在腫瘤治療方面，白藜蘆醇有與化放療、內分泌治療等協(xié)同提高療效作用[21-25]，有逆轉化療耐藥[26-27]和降低化放療不良反應作用[28]，上述研究提示，白藜蘆醇通過多種機制抑制腫瘤細胞生長和影響腫瘤微環(huán)境。其中，白藜蘆醇抑制腫瘤血管生成可能與其抑制腫瘤轉移灶形成密切相關。本研究顯示，rhIL-11+白藜蘆醇組出現(xiàn)轉移病灶的裸鼠數(shù)小于rhIL-11處理組(3/12對7/12)，雖然差異無統(tǒng)計學意義，但絕對數(shù)有較大差別，而且在轉移灶個數(shù)方面，rhIL-11+白藜蘆醇組也小于rhIL-11組(5個對13個)，絕對數(shù)也有較大差別。兩組之間的差別無統(tǒng)計學意義考慮與樣本量太小有關。故本研究認為，rhIL-11可能促進肺腺癌A549細胞的轉移灶形成，而白藜蘆醇可以減少腫瘤轉移灶的形成，有待于增加樣本量進一步研究。

分期越晚的腫瘤患者，循環(huán)中的腫瘤細胞就越多，循環(huán)腫瘤細胞的多少也成為評估預后的指標之一[29-30]，循環(huán)中的腫瘤細胞在有利于腫瘤細胞生長的環(huán)境下就可以形成轉移瘤病灶。本研究從裸鼠的尾靜脈注入肺腺癌A549細胞，模擬循環(huán)腫瘤細胞。與rhIL-11處理組比較，rhIL-11+白藜蘆醇組出現(xiàn)轉移病灶的裸鼠數(shù)(3/12對7/12)以及轉移灶個數(shù)(5個對13個)均較小，考慮白藜蘆醇可能影響腫瘤微環(huán)境，阻礙循環(huán)腫瘤細胞形成轉移病灶。

綜上所述，rhIL-11可促進肺腺癌A549細胞轉移灶的形成，而白藜蘆醇可抑制轉移病灶的形成。