PM2.5對小鼠肺部自噬、核因子相關因子2、核因子κB表達影響實驗研究*

杜旭升，李東繁

西安交通大學醫學院附屬西安市中心醫院呼吸與危重癥醫學科(西安710003)

近年來，汽車尾氣、煤炭燃燒、建筑揚塵等產生的大量顆粒物，使大氣污染愈發嚴重，由此形成的霧霾天氣對人類日常活動和生命健康產生嚴重影響。在空氣污染物中，細顆粒物(PM2.5)顆粒細小，傳播遠，表面有致病菌、重金屬、多環芳烴等多種有毒有害物質，且可直接作用于下呼吸道，對呼吸系統疾病的影響最為明顯[1]。自噬對細胞穩態的維持具有重要意義，為機體主要的溶酶體降解途徑，研究發現，PM2.5等的外界刺激可引起活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平增加，使機體產生氧化應激反應，進而促使自噬的增強[2]。核因子相關因子2(Nuclear factor related factor 2，Nrf2)屬于抗氧化調節因子，能夠通過介導抗氧化因子的表達，達到減輕機體氧化應激反應的效果。核因子κB(NF-κB)為真核細胞中的核轉錄因子，機體中主要以p50/p65異二聚體形式存在，能夠與多種細胞基因位點進行特異性結合， NF-κB與機體腫瘤壞死因子-α、白介素-6等炎癥因子的相關性已被多項研究證實[3]。目前關于PM2.5對肺部自噬及Nrf2、NF-κB表達的影響機制尚未完全明確，因此，本研究通過建立不同濃度的PM2.5小鼠模型，對此進行了相關研究。

材料與方法

1 材 料 TEMED購自Amresco公司，磷酸酶抑制劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液和PMSF購自碧云天公司，兔抗P65、兔抗Nfr2購自武漢三鷹公司，胞漿胞核蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物公司，兔抗LC3B 購自Cell signaling公司，HRP標記羊抗兔二抗、HRP標記羊抗小鼠二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。選取SPF級BALB/c雄性小鼠32只，體質量18～20 g，隨機分為正常組、低劑量組、中劑量組和高劑量組、每組8只。

2 實驗方法 ①PM2.5制備： 于2016年11月15日起，將西安交通大學醫學部實驗樓頂作為PM2.5采集點，使用PM2.5中流量大氣顆粒物采樣器進行PM2.5的收集，連續收集兩周。將采樣濾膜剪碎后，置于甲醇中，并進行超聲、洗脫、過濾、烘干等操作后，置于冰箱中保存備用。②PM2.5動物模型的制作： 使用具有通風口的4 L有機玻璃容器，正常組使用生理鹽水，低劑量組、中劑量組和高劑量組使用PM2.5，濃度分別為25 mg/L、50 mg/L和100 mg/L，通過霧化進入容器中，每次將不同組別小鼠置于容器中熏繞30 min，3次/d，連續進行4周。于末次熏繞1 h后，將小鼠通過眼球放血進行處死，隨后將肺臟取出，置于4%甲醛溶液中保存備用。

3 觀察指標 ①不同濃度PM2.5對小鼠肺組織的影響： 將不同組別小鼠肺組織石蠟包埋后，進行切片、熒光染色后，置于顯微鏡下觀察。②肺部自噬相關蛋白：LC3Ⅱ、 LC3Ⅰ表達的檢測 對四組小鼠使用Western blotting法進行肺部自噬蛋白LC3Ⅱ、 LC3Ⅰ表達的檢測，取小鼠肺部組織，勻漿后對肺部蛋白進行提取，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒對蛋白濃度進行測定，蛋白質電泳分離蛋白后，分別將一抗Beclin1、LC3加入，封閉過夜后，加入二抗，掃膜后對LC3的光密度值進行計算，并使用LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ表示肺部自噬結果。③不同濃度PM2.5對小鼠Nrf2、NF-κB表達的影響：四組小鼠使用Western blotting法進行肺部組織中Nrf2、NF-κB p65蛋白表達的檢測，取小鼠肺部組織，勻漿后對肺部蛋白進行提取，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒對蛋白濃度進行測定，蛋白質電泳分離蛋白后，分別將兔抗Nfr2、兔抗P65、二抗加入，掃膜后對Nfr2、P65的光密度值進行計算，并使用Nfr2/LaminB、P65/LaminB的光密度值表示檢測結果。④激光共聚焦顯微鏡下肺部細胞自噬的觀察： 將人支氣管上皮樣細胞(Beas-2B)細胞接種至24孔板，使細胞覆蓋至50%，培養后，分為兩組，其中對照組僅轉染pEGFP-LC3質粒，pEGFP-LC3質粒+PM2.5組在轉染pEGFP-LC3質粒后，將細胞置于PM2.5濃度為100 mg/L的環境中暴露48 h，使用激光共聚焦顯微鏡對細胞自噬情況進行觀察。

結 果

1 不同濃度PM2.5對小鼠肺組織的影響 正常組小鼠肺組織未見炎性改變，肺泡分布均勻、連接緊密，泡腔內無炎性細胞浸潤，小支氣管黏膜、支氣管壁結構完整，肺部毛細血管未見出血。低劑量組小鼠肺組織發生部分炎性改變，肺泡結構較為完整，相比正常組明顯偏大，肺泡中可見少量炎性改變，同時可見支氣管黏膜損傷，并伴有少量出血。中劑量組小鼠肺組織炎性改變進一步加重，肺泡中可見大量炎性改變，肺泡間隙明顯增加，并發生斷裂、融合。高劑量組小鼠肺組織中可見肺泡、肺泡間隙、支氣管被大量炎性細胞充滿，肺泡同時可見嚴重斷裂。見圖1。

注：A：正常組HE染色；B：低劑量組HE染色；C：中劑量組HE染色；D：高劑量組HE染色

圖1 不同濃度PM2.5對小鼠肺組織的影響(×100)

2 不同濃度PM2.5對小鼠肺部自噬相關蛋白LC3表達的影響 不同組別間，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ條帶分吸光度比值明顯不同(P<0.05)。與正常組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ條帶分吸光度比值明顯較高(P<0.05)，且呈現明顯的濃度效應關系(P<0.05)。見圖2、表1。

圖2 不同濃度PM2.5對小鼠肺部自噬相關蛋白LC3表達的影響

表1不同濃度PM2.5對小鼠肺部自噬相關蛋白LC3表達的影響

注：與正常組相比，*P<0.05；與低劑量組相比，#P<0.05；與中劑量組相比，△P<0.05

3 不同濃度PM2.5對小鼠肺部Nrf2、NF-κB表達的影響 正常組Nfr2/LaminB、NF-κB p65/LaminB的光密度值明顯低于低劑量組、中劑量組和高劑量組，PM2.5暴露可導致小鼠肺部細胞內Nfr2/LaminB、NF-κB p65/LaminB的光密度值明顯增加(P<0.05)，且具有明顯的濃度效應(P<0.05)。見圖3、表2。

4 激光共聚焦顯微鏡下肺部細胞自噬的觀察 對于僅轉染pEGFP-LC3質粒的細胞，LC3在胞漿中均一表達，部分細胞細胞核中見少量LC3蛋白聚集，熒光強度較弱。對于轉染的pEGFP-LC3質粒和PM2.5的細胞，LC3在細胞漿中呈現聚集性表達，細胞核內現少量明亮的熒光斑點，熒光強度明顯增強。見圖4。

圖3 不同濃度PM2.5對小鼠肺部Nrf2、NF-κB表達的影響

表2不同濃度PM2.5對小鼠肺部Nrf2、NF-κB表達的影響

注：與正常組相比，*P<0.05；與低劑量組相比，#P<0.05；與中劑量組相比，△P<0.05

討 論

PM2.5組成復雜，其內所含的多種毒害物質可伴隨呼吸運動下沉至肺部，隨后經由循環系統對神經系統、心臟等多個器官、系統產生危害，其中對于呼吸系統的影響最為直接[4]。有研究發現，無論PM2.5暴露時間為長期或者短期，均可對哮喘、慢阻肺、肺癌等呼吸系統疾病的發生發展產生一定影響[5]。目前多認為PM2.5對機體呼吸系統的影響主要通過氧化應激反應和炎癥反應進行[6]。有研究發現，PM2.5進入機體后，可導致氧化-抗氧化平衡被打破，使ROS自由基在體內發生滯留，鈣離子濃度增加，進而引起肺組織的氧化應激損傷[7]。也有研究發現，PM2.5能夠成濃度依賴性的激活促炎因子基因的表達，并可使機體對病原菌的清除能力降低，進而使炎癥因子水平提升，增加肺部感染發生的風險[8]。此外，PM2.5還可使細胞內鈣離子濃度增加，促使鈣離子信號通路激活，刺激炎癥因子的釋放[9]。本研究對不同濃度PM2.5對小鼠肺組織的影響進行了研究，結果表明，PM2.5對小鼠肺組織的影響呈現濃度依賴性，隨著PM2.5濃度的增加，小鼠肺組織中的肺泡結構受損明顯增強，炎性細胞浸潤更為明顯。

圖4 激光共聚焦顯微鏡下肺部細胞自噬的觀察

自噬為機體細胞的程序性死亡，是面對內外刺激時，機體產生的非損傷性應答。當發生自噬時，細胞質中處于游離狀態的LC3Ⅰ逐漸轉化為LC3Ⅱ，因此LC3Ⅱ/LC3Ⅰ可以用來表示細胞自噬程度。本研究結果發現，隨著PM2.5濃度的增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明顯增加，表明PM2.5能夠促進肺部細胞自噬的發生，且肺部細胞自噬程度呈現PM2.5濃度依賴性。本研究隨后于激光共聚焦顯微鏡下對Beas-2B的自噬進行觀察，結果證實PM2.5能夠促進肺部細胞自噬的發生。有研究認為，PM2.5對小鼠肺部自噬的影響可能是通過對肺泡上皮細胞氧化應激的誘導產生[10]。也有學者對PM2.5對肺癌細胞自噬的影響進行了研究，結果表明，PM2.5可引起肺癌細胞的自噬，通過對自噬的阻礙有利于促進肺癌細胞的凋亡[11]。研究發現，對于腦缺血大鼠模型，適度自噬有助于對神經系統的保護，當自噬過度發生則會對大鼠神經功能產生影響，而通過對自噬抑制能夠有效降低腦缺血損傷[12]。關于自噬程度對肺部疾病的影響還需進行更為深入的研究。

Nrf2為調節機體氧化應激反應的重要因子，其能夠通過與ARE作用，達到對抗氧化蛋白的調控作用，進而起到降低外來刺激、機體炎癥反應以及保護機體功能的效果[13]。研究發現，PM2.5能夠刺激肺部組織Nrf2的表達，促進卵泡抑素的釋放，使NADPH氧化酶-1分泌減少，進而使機體抗氧化能力提升[14]。本研究發現，PM2.5對小鼠肺組織Nrf2的影響呈濃度依賴性，隨著PM2.5濃度的增加，Nrf2表達明顯增強，提示PM2.5能夠引起機體的氧化應激反應，進而對肺部組織產生損傷。NF-κB在調節炎癥因子釋放的過程中具有多向性，PM2.5可引起肺泡上皮細胞釋放多種炎癥因子，研究發現，這些因子的釋放可能與NF-κB信號通路的激活有關，PM2.5可致機體產生氧化應激反應，刺激了NF-κB的表達，進而使炎癥反應增加[15-16]。本研究發現，NF-κB的表達與PM2.5濃度變化呈現濃度依賴性，隨著PM2.5濃度的增加，小鼠肺部組織中NF-κB p65的水平明顯增加，進一步驗證了PM2.5與肺部炎性改變的相關性。

綜上所述，PM2.5能夠使小鼠肺部組織發生炎性改變，且呈濃度依賴性的提高小鼠肺部自噬、Nrf2以及NF-κB水平，提示PM2.5通過使機體產生氧化應激以及炎癥反應，導致肺部組織損傷，然而關于PM2.5對肺部病變的影響機制有待進一步的研究。