丁苯酞對阿爾茨海默病模型大鼠海馬CA1區腦源性神經營養因子和堿性成纖維生長因子蛋白表達影響的實驗研究*

鄧春穎，李海濱，毛文靜，李世英，劉 斌△

1．華北理工大學附屬醫院(唐山063000)；2.河北省遵化市人民醫院(唐山063000)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)中樞神經系統慢性退行性疾病，多發于老年人，主要臨床表現為記憶力下降、執行能力下降、人格及行為改變，嚴重時甚至會出現精神癥狀，嚴重影響患者的日常生活，給家庭和社會帶來沉重的負擔[1]。其發病機制尚不十分明確，較為公認的學說包括炎癥與免疫學說、氧化應激學說、中樞膽堿能損傷學說等[2]。腦源性神經營養因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是一種廣泛存在于海馬和皮層的神經營養因子，其表達增加可影響AD模型大鼠學習記憶能力[3-4]。堿性成纖維生長因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)對神經元及神經膠質細胞等有神經營養作用[5]，其表達量對AD大鼠認知功能恢復有促進作用。丁苯酞(dl-3-N-butylphthalidle，NBP)是一種新藥，目前主要應用于缺血性腦血管病，主要通過拮抗自由基、保護損傷的神經元起到腦保護作用。另有研究表明，NBP具有拮抗炎性反應、抑制神經元凋亡、保護受損的腦細胞等作用，主要通過對細胞內鈣離子調節發揮作用的。本實驗通過研究NBP對AD模型大鼠海馬CA1區BDNF和bFGF蛋白表達，探討NBP對AD模型大鼠腦保護作用的機制。

材料與方法

1 材 料

1.1 實驗動物：選取72只2～3個月齡250～280 g健康清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(北京華阜康生物科技有限公司)，合格證號為：SCXK[京]2014-0010。于華北理工大學屏障環境動物實驗室喂養大鼠，室溫、濕度適宜，12 h明暗交替光照，實驗前適應喂養一周。

1.2 藥物與試劑：丁苯酞軟膠囊(國藥準字H20050299，批號121101，0.1 g/粒)。一抗：兔抗大鼠BDNF多克隆抗體(購自北京博奧森生物公司)、兔抗大鼠bFGF抗體(購自北京博奧森生物公司)；兔二步法免疫組化試劑盒(北京中杉生物有限公司)；DAB 顯色液(北京中杉生物有限公司)。DAB 顯色液、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳低分子質量標準蛋白(北京中杉生物有限公司)。

1.3 主要儀器：石蠟組織切片機(德國LEICA公司)。透射電子鏡(日本HITACHI公司)。腦立體定位儀(安徽淮北正華生物儀器設備有限公司)。Morris 水迷宮(淮北正華生物儀器設備有限公司)。電凝儀(張家港市航天醫療電器有限公司)。

2 研究方法

2.1 動物分組：實驗大鼠隨機分為假手術組(Sham)組、AD模型組(AD)組、丁苯酞治療組(NBP)組，造模成功后，將上述各組隨機分為造模后 1、2、4 和 8 周 4 個亞組。

2.2 模型制備：用無菌生理鹽水處理Aβ1-42，制成濃度為1 μg/μl溶液，將其孵育達到凝聚狀態。通過Morris水迷宮篩選實驗動物，去除先天性癡呆及游泳姿勢不良等大鼠。10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，應用腦立體定位儀定位，向AD組及治療組大鼠雙側海馬CA1區注入5 μl聚集態1 μg/μl Aβ溶液，然后緩慢撤出針頭，用骨蠟封閉骨質創口，縫合切口皮膚，手術區用硫酸慶大霉素注射液消毒。Sham組注射5 μl生理鹽水。

2.3 給藥方法:NBP組將NBP與食用油混合后制成的NBP混合溶液進行灌胃(濃度8 mg/ml，劑量1 ml/100 g)，每日2次；Sham組和AD組采用同等劑量的食用油進行灌胃，對各組大鼠進行灌胃處理，每日2次，分別連續給藥1、2、4、8周。

2.4 行為學測試:采用Morris水迷宮實驗測試實驗造模成功給藥后大鼠的學習記憶能力[3]。采用水迷宮實驗分別觀察各組大鼠灌胃后1周、2周、4周和8周穿越平臺的次數。

2.5 免疫組織化學檢測:腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉大鼠后，快速灌注0.9%氯化鈉溶液，排出血管內血漬、肝臟變白后，滴注4%多聚甲醛至大鼠全身肌肉僵硬，斷頭取腦，并剝離腦組織，4%多聚甲醛-PBS固定過夜后石蠟包埋含海馬的腦組織切片備用。取組織標本，加入羊血清封閉液，滴加一抗，20 μl抗BDNF蛋白(1∶300)、抗bFGF蛋白(1∶200)4℃過夜，滴加二抗孵育1 h，進行DAB顯色。具體操作步驟按試劑說明書操作要求進行。BDNF、bFGF免疫組織化學陽性標準，細胞胞漿和胞核呈棕褐色。應用OLYMPUS攝像顯微鏡(400×)對組織切片采集圖像，隨機觀察各組大鼠海馬CA1區不重疊的6個視野，應用 Motic Med 6.0 數碼醫學圖像分析系統。

2.6 Western blot檢測:各組實驗大鼠喂養至各個時相點后，麻醉、斷頭、取腦組織，加入組織裂解液后研磨裂解40 min，離心后將清液置于-80℃冰箱保存備用。將蛋白定量、分裝，調蛋白濃度至800 μg/ml，加等體積的上樣緩沖液，置于沸水中煮5 min。冷卻后放入4℃冰箱備用。

檢測方法：取等量蛋白樣品(50 μg)置于10% SDS聚丙烯酸銨凝膠電泳，以濕轉法電轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上，室溫封閉2 h。分別加入一抗，抗BDNF蛋白(1∶500)、抗bFGF蛋白(1∶400)，4℃冰箱過夜，次日漂洗后加羊抗兔二抗(1∶2000)，于37℃環境反應2 h，PBS洗膜后加BCIP/NBT顯色數分鐘，雙蒸餾水終止顯色，Image J軟件進行灰度值測定分析。

結 果

1 各組大鼠學習記憶能力的檢測結果 與Sham組比較，AD組大鼠穿越平臺次數明顯減少(P<0.01)；與AD組比較，NBP組大鼠穿越平臺次數增加(P<0.01)。見表1。

2 各組大鼠海馬CA1區BDNF檢測結果

2.1 免疫組化法結果:BDNF蛋白在Sham組大鼠各時間點海馬CA1區均可見少量表達。在AD組大鼠各時間點表達增多，1周時有多量表達，2周時表達繼續增多，4周時表達量最高，8周時稍有下降但仍處于較高水平。與Sham組相比，BDNF蛋白在AD組大鼠各時間點表達增多，差異有統計學意義(P<0.01)；與AD組比較，BDNF蛋白在NBP組大鼠各時間點表達明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2、圖1。

表1各組大鼠穿越平臺次數(次)

注：與Sham組比較，*P<0.01；與AD組比較，#P<0.01

表2各組大鼠海馬 CA1 區 BDNF 免疫組化結果(個/高倍視野)

注：與Sham組比較，*P<0.01；與AD組比較，#P<0.01

注：A為Sham組；B為AD組；C為NBP組；1、2、3、4 分別為1、2、4、8周

2.2 Western blot檢測結果:BDNF蛋白在假手術組大鼠各時間點海馬CA1區有少量表達。與假手術組相比，BDNF蛋白在AD模型組各時間點表達明顯增多，差異有統計學意義(P<0.01)，4周時達高峰。與AD模型組比較，BDNF蛋白在NBP治療組各時間點表達明顯減少，差異有統計學意義(P<0.01)。見表3、圖2。

表3各組大鼠海馬 CA1 區BDNF Western blot結果

注：與Sham組比較，*P<0.01；與AD組比較，#P<0.01

圖2 各組大鼠海馬CA1區BDNF Western blot結果

3 各組大鼠海馬CA1區bFGF檢測結果

3.1 免疫組化法結果：bFGF蛋白在Sham組大鼠各時間點海馬CA1區均可見少量表達。在AD組大鼠各時間點表達增多，1周時有多量表達，2周時表達繼續增多，4周時表達量最高，8周時稍有下降但仍處于較高水平。與Sham組相比，bFGF蛋白在AD組大鼠各時間點表達增多，差異有統計學意義(P<0.01)；與AD組比較，bFGF蛋白在NBP組大鼠各時間點表達明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)。見表4、圖3。

表4各組大鼠海馬 CA1 區 bFGF 免疫組化結果(個/高倍視野)

注：與Sham組比較，*P<0.01；與AD組比較，#P<0.01

注：A為Sham組；B為AD組；C為NBP組；1、2、3、4 分別為1、2、4、8周

3.2 Western blot檢測結果:bFGF蛋白在假手術組大鼠各時間點海馬CA1區有少量表達。與假手術組相比，bFGF蛋白在AD模型組各時間點表達明顯增多(P<0.01)，4周時達高峰。與AD模型組比較，bFGF蛋白在NBP治療組各時間點表達明顯減少，差異有統計學意義(P<0.01)。見表5、圖4。

表5各組大鼠海馬 CA1 區bFGF Western blot結果

注：與Sham組比較，*P<0.01；與AD組比較，#P<0.01

圖4 各組大鼠海馬CA1區bFGF Western blot結果

討 論

AD是全世界最普遍的癡呆癥，多發生于中年或老年的早期，病初有輕度認知功能障礙，隨著病情進展，發展為嚴重的不可逆的神經變性、認知功能退化、精神行為異常。目前治療AD公認的有效藥物包括多奈哌齊、美金剛、加蘭他敏、卡巴拉汀等，本文為AD治療發現新的藥物。NBP是從芹菜種籽內分離得到，呈黃色油狀液體，是我國自主研發的擁有知識產權的新藥。它具有改善腦部微循環、保護線粒體等作用，近年來研究表明NBP還具有神經保護、促進認知功能恢復、抑制Aβ沉積、抗炎等[6-9]作用。本研究測試了實驗大鼠的學習記憶能力，與AD組比較，NBP組大鼠穿越平臺次數增加，表明NBP能改善AD大鼠的學習記憶能力，并且研究其可能機制。

BDNF是1982年Barde等在豬腦中發現的一種具有神經營養作用的蛋白質，廣泛存在于神經系統中，尤其是中樞神經系統，海馬和皮質表達量最高，對神經元的分化、生長有重要作用[10]。BDNF 可通過多種途徑保護受損細胞，促進神經功能恢復。無論在體內或體外條件下，BDNF均能促進膽堿能神經元的分化和存活。BDNF通過調節突觸可塑性、促進神經發生尤其是海馬的神經發生，改善已經破壞受損的學習及記憶能力，BDNF增加可改善AD大鼠的學習記憶能力[11-12]。本實驗結果顯示，AD大鼠海馬CA1區BDNF高于Sham組，當神經功能缺失、神經細胞退化，可刺激腦組織內BDNF表達，保護神經功能、修復神經元。給予NBP治療后的大鼠，腦組織海馬CA1區BDNP表達量進一步增多，明顯高于AD組，證明NBP能明顯增加AD大鼠腦組織內的BDNF表達，同時大鼠學習記憶能力也得到改善。Lv等[13]研究表明，NBP能改善快速老化鼠學習記憶能力，并能上調BDNF表達，與本實驗結果一致。

bFGF是1940年在腦和垂體發現的一種能夠促進成纖維細胞生長的物質，是含有155個氨基酸的多肽生長因子，能提高神經元的存活、誘導軸突向外生成，能促進神經干細胞增殖、抑制分化[14-18]。bFGF能對抗多種損傷，如缺血、低血糖、自由基等，故而起到對神經元的保護作用。在大鼠學習記憶和鍛煉過程中bFGF mRNA水平上升。本研究結果顯示，AD大鼠海馬CA1區bFGF高于Sham組，當神經功能缺失、神經細胞退化，可刺激腦組織內bFGF表達，保護神經功能、修復神經元。給予NBP治療后的大鼠，腦組織海馬CA1區bFGF表達量進一步增多，明顯高于AD組，證明NBP能明顯增加AD大鼠腦組織內的bFGF表達，而且大鼠學習記憶能力也得到改善。

綜上研究顯示，NBP改善AD模型大鼠的學習記憶能力，可能是通過上調BDNF和bFGF的表達而實現的，為AD治療提供新思路。