基于高通量測序研究豬功能microRNA的研究進展

文│張振 倪和民 郭勇 張永紅 邢凱（北京農學院動物科學技術學院）王楚端（中國農業大學動物科技學院）

microRNA（miRNA）是一類由大約22個核苷酸組成的小非編碼RNA，廣泛的參與了生物的各種生命活動。高通量測序技術為miRNA的發現、挖掘miRNA生物學功能提供了新的技術手段和平臺。本文綜述了高通量測序技術挖掘豬在脂肪代謝、肌肉發育、繁殖生理、免疫應答等方面功能miRNA的研究進展，旨在為研究miRNA功能和豬品種的遺傳改良提供新的理論基礎和研究思路。

一、microRNA的簡介和作用機制

microRNA（miRNA）是一類由大約2 2 個核苷酸組成的小非編碼RNA，它可以通過與目標基因的3’UTR端的非編碼RNA結合抑制其翻譯或促進其降解，進而達到調控生物過程的目的。miRNA在真核生物中廣泛的表達，是一類具有高度的保守性和內源性的轉錄后調控因子。miRNA的表達具有位相性和時序性，在不同發育階段、組織中的表達差異顯著。目前為止，生物體內已經有超過2000個miRNA被證實。在細胞信號傳導、細胞周期、分化和增殖的過程中，超過60%基因的表達直接miRNA的調控。在豬上，miRNA已經被證實參與了多個生理和病理上的調控。

miRNA調控靶基因表達的方式主要有兩種：靶基因mRNA的剪切降解和抑制靶基因的翻譯。沉默復合物（miRNA-induced silencing complex,miRISC）中的AGO（argonaute,AGO）蛋白引導miRNA識別靶基因，當二者的序列完全配對時引起靶基因mRNA的剪切和降解。另一種情況是miRNA可以通過種子序列（一般為miRNA的第2～8nt）與靶基因mRNA的堿基互補配對抑制其翻譯。成熟的miRNA不僅可以通過與靶基因mRNA的3’UTR結合發揮調控作用，也可與5’UTR及CDS區結合。可見，miRNA在生命過程中發揮調控作用的途徑是多種且復雜的。

二、microRNA的生物合成過程

miRNA的生物合成過程基本上已經被證實。根據miRNA在基因上的位置，miRNA可以分為存在于內含子上的miRNAs和大多數的存在于無效編碼蛋白質的基因間miRNAs。內含子miRNAs與它的宿主基因一起被轉錄，而基因間miRNAs大多數情況下具有包括啟動子和終止子的獨立轉錄單元。miRNA基因可以通過RNA聚合酶Ⅱ或RNA聚合酶Ⅲ進行轉錄，其中大部分基因間的miRNAs和所有的內含子miRNAs是通過RNA聚合酶Ⅱ轉錄。可能含有幾千個堿基的初級miRNA被蛋白復合酶 Drosha切割成具有70個核苷酸左右的莖環狀前體miRNA。細胞核內的前體miRNA被轉運到細胞質，然后被Dicer加工成成熟的原始雙鏈miRNAs。

成熟的雙鏈miRNAs與miRNA-誘導的沉默復合物（miRNA-induced silencing complex, miRISC）結合后，其中一條鏈（miRNA）被降解。細胞核內的前體miRNA被轉運到細胞質，然后被Dicer加工成成熟的原始雙鏈miRNAs。成熟的雙鏈miRNAs與miRNA-誘導的沉默復合物（miRNAinduced silencing complex, miRISC）結合后，其中一條鏈（miRNA）被降解。MiRNA和miRNA-誘導的沉默復合物一起轉運到靶基因處，通過miRNA的種子序列與靶基因序列的結合發揮生物學作用。

三、研究microRNA的方法及高通量測序優點

miRNA可以通過計算機軟件預測和試驗檢測的方法進行研究。計算機軟件預測miRNA的原理主要是基于miRNA的序列信息、二級結構（發夾環結構）、熱力學穩定性和物種保守性等，主要軟件有MirScan、miRseeker、miRAlign、MiRRim、ProMiR、Mireval、MiRFinder、miPred、miRanalyzer等。鑒定miRNA的試驗方法主要有克隆測序、Northern雜交技術、熒光原位雜交技術、熒光定量PCR技術、miRNA表達芯片技術和miRNA組測序技術等。隨著高通量測序技術的快速發展，miRNA組測序技術有著準確度高、通量大、測序成本不斷下降、運行時間短等優點，已經被廣泛地應用于挖掘豬功能miRNA中。

四、高通量測序技術在挖掘豬功能microRNA的研究進展

miRNA在豬肌肉、脂肪、生殖系統、免疫系統等發育過程中發揮著重要的調控作用。另外，高通量測序技術在豬microRNA的挖掘和差異表達研究中發揮著較大的作用。基于高通量測序技術挖掘豬microRNA主要在脂肪代謝、肌肉發育、繁殖生理、免疫應答等過程相關的組織中，為miRNA在這些過程中的作用提供理論基礎和研究思路。

1.脂肪代謝。Bai等利用SOLID平臺對閹割和未閹割公豬背膘組織miRNAs進行了大規模的測序，共鑒定出177個差異表達microRNA，其靶基因主要富集在細胞增殖、凋亡、分化等過程中，為深入研究閹割對脂肪的影響奠定了良好的基礎。

Mentzel等采用高通量測序技術檢測了肥胖型、瘦肉型的公豬和母豬的脂肪組織的microRNA表達水平，發現mir-124a、mir-9等在肥胖型豬上高表達，為揭示其功能提供了基礎。

Li等比較了長白豬和藍塘豬的脂肪組織的microRNA組，檢測到25個microRNA在長白豬中高表達和23個在藍塘豬中高表達，為揭示microRNA在脂肪沉積中的功能提供了基礎。

Ma等比較了肌間脂肪和皮下脂肪的microRNA組，檢測到在二者中差異表達的microRNA主要參與了免疫和炎癥反應，為肥胖的研究提供了新的視角。

Gaffo等采用高通量測序技術檢測了伊比利亞白豬皮下脂肪的microRNA，共發現222個已知的microRNA，68個新的microRNA和17個miRNA-offset，其中表達最豐富的microRNA可能參與了Wnt信號通路和軸突通路，闡明了部分microRNA參與脂肪代謝的生物學功能。

Chen等比較了大白豬和梅山豬背膘組織的microRNA，檢測到8個差異表達的microRNA，其中miR-135和miR-183可能通過WNT信號通路影響豬背部皮下脂肪組織的發育。

Miao等檢測了金華豬和長白豬的肌內脂肪組織內的miRNA，發現了大量參與脂肪酸代謝的miRNAs，為闡明miRNA調控肌內脂肪提供了基礎信息。

Liu等比較了出生前70天胚胎和出生后70天仔豬肝臟的miRNA組，發現miR-122、miR-26a、miR-199a-5p和miR-30a-5p在脂類代謝的過程中起到了重要的作用。

Liu等比較了具有極端差異背膘厚度豬的脂肪組織miRNA，發現miR-31-5p可能通過調控AQP9和GLIPR1基因的表達影響豬皮下脂肪的沉積。

Davoli等同樣比較了不同背膘厚度豬背膘中的miRNA，發現31個差異表達的miRNA，并構建了潛在的調控網絡。

Sun等比較了顯著差異肌內脂肪含量的大約克豬的肌肉組織的miRNA，發現miR-365-3p可能調控了肌內脂肪生成的過程。

2.肌肉發育。C h e n 等利用Illumina 測序平臺對萊蕪豬和大約克豬的背最長肌組織miRNAs進行了高通量測序，發現了19個顯著差異表達的microRNA，其結果為肌肉在不同豬種之間的發育提供了研究基礎。

Z h a n g 等比較了注射脂多糖和生理鹽水豬的背最長肌組織的microRNA組，鑒定得到9個差異表達的microRNA，為脂多糖在肌肉中發揮的作用奠定了理論基礎。

Mai等利用高通量測序技術檢測豬5個發育時期的microRNA，共發現了404個已知的豬microRNA和118個新的microRNA，其中部分在基本肌肉功能中發揮重要作用，還有部分參與了肌肉的分化和形態發育的過程，這些發現為了解microRNA在肌肉中的全面功能提供了基礎。

Hou等采用Solexa測序技術檢測了豬肌肉18個發育階段的microRNA，共發現197個已知的microRNA和78個新的microRNA，檢測到部分microRNA及其靶基因參與了生肌作用、BMP2、MAPK1信號通路等通路，為microRNA在肌肉發育中的作用提供了理論基礎。

Li等檢測了長白豬和藍塘豬的肌肉組織的microRNA組，發現21個microRNA在藍塘豬肌肉組織中高表達和33個microRNA在長白豬中高表達，為揭示microRNA在肌肉發育中的功能提供了基礎。

Liu等檢測了氧化型和糖酵解型的肌肉組織中的microRNA，發現了114個保守的microRNA和89個新的microRNA，其中顯著差異表達miR-133、miR-23可能參與了影響能量代謝的通路。

Q i n 等 采 用S o l e x a 測 序 的 方法檢測了豬骨骼肌1 0 個發育時期的microRNA，發現247個已知的microRNA和297個新的microRNA，其中15個最豐富表達的microRNA可能參與了肌纖維分化的過程。

Siengdee等檢測了母豬懷孕后63天、90天和仔豬出生后180天的肌肉組織的microRNA組，其中部分差異表達的microRNA參與了肌肉發育的過程，為肌肉發育的microRNA調控提供了基礎。

Sheng等比較了大白豬和民豬出生后60天、120天、150天、180天和210天的肌肉組織的miRNA組，發現了ssc-miR-204可能參與了成肌細胞的增殖過程。

Xi等比較了通城豬和大白豬肌肉組織的miRNAomes，發現miR-499-5p可能通過降解肌動蛋白解聚因子（destrin/actin depolymerizing factor,DSTN）發揮調控肌纖維發育的過程。

Hou等采用了Solexa測序的方法檢測了長白豬、通城豬和五指山豬的肌肉組織的miRNA，發現了多個參與肌肉發育的miRNA。

Zhang等比較了長白豬和五指山豬早期發育的四個時期（配種后18天、21天、28天和35天）的背最長肌組織的轉錄組，發現多個參與調控豬肌肉早期發育的miRNA。

3.繁殖生理。Lian等比較了公豬未成熟（30天）和成熟（180天）的睪丸組織microRNA組，檢測到122個差異表達miRNA，通過分析發現，其靶基因在生精作用中起著重要作用。

Bidarimath等基于高通量測序結果比較了母豬配種后20天和50天的子宮內膜淋巴球、子宮內膜和滋養層的microRNA組，檢測到部分microRNA參與了免疫細胞發育、血管生成等，為microRNA在懷孕中的作用提供了新的視角。

Gu等檢測了母豬產仔后整個時期（至28天）母乳中的microRNA，為microRNA在母豬調控仔豬生長發育過程中提供了一定的研究基礎。

Peng等比較了哺乳期金華豬和約克夏豬的乳腺組織的microRNA組，檢測到多個差異表達的microRNA，其中部分microRNA參與了乳腺發育和產奶性能，為研究microRNA的在乳腺中的分子生物學功能奠定了基礎。

Luo等檢測了三個重要的生精時期豬的睪丸組織的microRNA，發現大量microRNA并進行了生物功能分析，為其在生精中的作用提供了基礎信息。

Huang等比較了高低產仔數的母豬的卵巢組織microRNA組，鑒定出37個差異表達microRNA，進一步通過靶基因預測發現，miR-224、miR-99a、let-7c、miR-181c、miR-214和miR-21可能影響母豬的產仔數。

4.免疫應答。Ye等利用SOLID測序鑒定了不同大腸桿菌抗性的豬腸道組織microRNA組，鑒定出58個差異表達miRNA，共對應2036個靶基因，經分析發現11個影響仔豬腹瀉的靶標microRNA。

Liu等通過高通量測序結果比較了感染豬巨細胞病毒感染前后豬巨噬細胞的microRNA組，檢測到239個已知的microRNA和355個新的microRNA，并發現130個顯著差異表達的microRNA，這些為microRNA的分子調控機制提供了新的視角。

Wu等檢測了感染大腸桿菌F18易感型和抵抗型豬的十二指腸的microRNA，檢測到了311個已知的microRNA，其中15個microRNA在易感組顯著高表達，9個microRNA顯著低表達，其中miR-218-3p可能通過靶向DLG5基因影響宿主對大腸桿菌的反應。

Wang等檢測了PolyI∶C刺激前后的大蒲蓮豬和長白豬外周血細胞的microRNA，分別檢測到20個和23個差異表達microRNA，揭示了部分microRNA調控宿主對RNA病毒的免疫反應機制。

Podolska等比較了感染胸膜肺炎放線桿菌的豬腎臟組織的microRNA組，檢測到29個差異表達的microRNA，其中mirR-155、miR-664-5p、miR-451等可能在炎癥反應中起到了重要作用。

Liu等檢測感染傳染性腸胃炎病毒前后的豬腎臟組織的microRNA組，鑒定到284個已知的microRNA，其中顯著差異表達的microRNA59個，其靶基因主要富集在細胞過程、代謝過程和免疫系統等通路，為進一步研究病毒預防和治療奠定基礎。

Li等比較了大白豬和確山黑豬的脾臟miRNA組，發現了參與免疫應答和疾病抗性的候選miRNA。

Zhen等比較了感染了豬藍耳病病毒的大白豬和通城豬肺巨噬細胞的非編碼RNA，發現miR-378、miR-199a-3p、miR-10a-5p等調控了抵抗豬藍耳病病毒的免疫應答過程。

Zhang等比較了感染和非感染豬藍耳病病毒的豬子宮內膜上皮細胞的miRNA組，發現miR-339-5p參與了細胞凋亡的過程。

5.其他。Zhang等比較了大白豬和藏豬的心肌組織的microRNA組，鑒定得到20個差異表達miRNAs，為研究microRNA在低氧適應性上的作用奠定了理論基礎。

Li等比較了藏豬和大約克豬的肝臟組織的microRNA組，鑒定出51個差異表達的miRNA，其中6個參與了葡萄糖和脂質的代謝，這些為揭示藏豬肝臟的分子作用機制提供了基礎。

Sharbati等利用高通量測序技術檢測了豬十二指腸、空腸、回腸和結腸的microRNA，共發現了332個已知的microRNA和201個新的microRNA，為全面了解microRNA調控腸道功能提供了基礎。

Xie等采用高通量測序技術檢測了豬的16個不同組織的microRNA，共檢測到437個保守的microRNA及86個候選的microRNA，這些發現為全面挖掘microRNA的生物學功能奠定了基礎。

Liu等采用高通量測序技術檢測了胚胎期90天、出生后30天及7年的成年豬的肝臟組織的microRNA組，檢測到部分參與了肝臟發育的microRNA，并且為microRNA的調控作用提供了新的有價值信息。

Zhang等采用高通量測序和表達芯片技術檢測了60日齡、120日齡和180日齡豬的垂體和丘腦組織的microRNA，在不同時期分別發現37個和30個差異表達microRNA，為了解腦部功能提供了新的知識。

Tao等采用高通量測序技術比較了斷奶和不斷奶1天、4天和7天仔豬的小腸組織的microRNA，分別檢測到16、98和22個差異表達microRNA，通過生物信息學分析發現這些microRNA可能參與了小腸的新陳代謝、壓力應激和免疫功能。

Li等檢測了出生前和出生后混合組織的microRNA組，找到大量特異性表達的microRNA，為研究豬microRNA提供了新的廣闊視角。

P a w l i n a 等檢測了豬肝臟組織的microRNA，共鑒定出206個microRNA，其中68個是新的候選microRNA，表達最豐富的micorRNA的靶基因主要富集在細胞代謝、生長激活和酶活性等通路，為進一步研究肝臟microRNA提供了基礎。

Sun等比較了大白豬和藏豬胃組織的miRNA，差異表達miRNAs，miR-214-3p和ssc-un39可能導致了二者消化能力不同的結果。

Huang等比較了金華豬和長白豬肝臟組織的miRNA組，共發現35個差異表達的miRNA，這些miRNA可能參與了調控豬生長和代謝的過程。

Chen等分析了貴州小型豬3個生長階段（0天、30天和240天）9個組織（脂肪、肌肉、心臟、肝臟、腎臟、肺、脾、卵巢和睪丸）的miRNAs，發現miRNA全面參與了豬生長發育的過程。

五、展望

綜上所述，可以看出miRNA廣泛參與了豬不同生長階段的生長發育、脂肪代謝、肌肉生長、繁殖生理、免疫應答等各個生理過程。高通量測序技術已經成為鑒定miRNA表達豐度和新miRNA的重要技術手段。同時，結合其他組學的測序結果，高通量測序技術也為鑒定miRNA的靶基因和生物學功能提供了新的思路。但是，大部分研究只是預測了miRNA的功能，其分子調控和遺傳機制還有待進一步研究。miRNA所調控的信號通路和基因表達的分子機制，將是在此基礎上未來研究的重點。