利用多重PCR鑒定西瓜雜交種純度

楊會會 李賀威 趙永威 袁升凱 楊路明 胡建斌 孫守如 馬長生 朱華玉

摘 要： 為快速、高效鑒定西瓜雜交種純度，建立一套完善的SSR分子標記鑒定體系，利用覆蓋西瓜全基因組的192對SSR標記對小果型西瓜品種‘錦霞八號親本進行多態性篩選，共獲得36個條帶清晰、多態性好的SSR標記，多態性率為18.8%，這些標記分別位于西瓜第1、2、3、4、5、6、8、10、11號染色體。根據這些多態性標記的擴增片段大小，從中選出4對進行雙重PCR和三重PCR分組擴增，成功建立了‘錦霞八號雜交種的雙重和三重PCR純度鑒定體系。3組標記鑒定結果基本吻合，‘錦霞八號雜交種的純度為100%。將標記鑒定結果與田間形態學鑒定結果對比，2種方法鑒定的結果高度一致。將三重PCR技術用于鑒定西瓜雜交種純度，為西瓜雜交種純度快速高效鑒定奠定了研究基礎。

關鍵詞： 西瓜; 分子標記; 多重PCR; 純度鑒定

中圖分類號：S651? ?文獻標志碼：A? ?文章編號：1673-2871（2020）02-017-05

Identification of purity of watermelon hybrids by multiplex PCR

YANG Huihui1， LI Hewei1， ZHAO Yongwei2， YUAN Shengkai1，2， YANG Luming1， HU Jianbin1， SUN Shouru1， MA Changsheng1，2， ZHU Huayu1

（1. College of Horticulture， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China; 2. Henan Yuyi Seed Industry Technology Development Co.， Ltd.， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： In order to quickly and efficiently identify the purity of watermelon hybrids， a complete SSR molecular marker identification system was established. In this study， 192 pairs of SSR markers covering the whole genome of watermelon were used to screen polymorphisms of the small fruit watermelon variety ‘Jinxia No. 8， and 36 bands with clear and polymorphic SSR markers were obtained，the polymorphism rate was 18.8%， and these markers were located on chromosomes 1， 2， 3， 4， 5， 6， 8， 10， and 11， respectively. Based on the amplified fragment size of these polymorphic markers， 4 pairs were selected for double PCR and triple PCR group amplification， and the double and triple PCR purity identification systems of ‘Jinxia No. 8 hybrids were successfully established.The results of the three pairs of markers were basically consistent， and the purity of the ‘Jinxia No.8 hybrid was 100%. The results of marker identification were highly consistent with those of field morphological identification.For the first time， the triple PCR technique was used to identify the purity of watermelon hybrids， which laid a solid foundation for the efficient and rapid identification of watermelon hybrids.

Key words： Watermelon; Moleculer marker; Multiplex PCR; Purity identification

西瓜（Citrullus lanatus）為葫蘆科西瓜屬一年蔓生草本植物，是世界上重要的園藝作物之一。中國是西瓜最大的生產和消費國，西瓜栽培歷史悠久。在育種過程中，因品種鑒定所需周期較長，費用較高，且鑒定的結果具有不確定性，所以種子的純度鑒定是一項難題，而種子的質量直接影響農產品的品質及農民的收益，因此，對雜交種進行純度鑒定以保證種子質量及生產效益是極其必要的[1]。常用的種子純度鑒定方法有形態學鑒定和分子鑒定。傳統的形態學鑒定易受環境、氣候和人為因素的影響，且存在費時費地費力等缺點[2]。利用分子標記技術能夠從DNA水平上檢測雜交種和親本之間的差異，克服了空間的限制，極大縮短了檢驗所需時間[3]。目前常見的分子標記有RAPD標記、SRAP標記、EST-SSR標記等，但是利用這些標記進行純度鑒定具有局限性，而SSR標記具有數量豐富、共顯性遺傳、重復性好、操作簡便等優點，適于進行雜交種純度的鑒定[4-5]，如孫波等[6]利用SSR分子標記技術對西瓜品種‘雪龍三號進行種子純度鑒定，鑒定結果驗證了西瓜品種的真實性。但是研究者多數是利用單一PCR擴增鑒定品種真實性，此做法雖然可以區分出親本自交株，但是對于品種間的機械混雜則難以區分。

多重PCR（multiplex PCR，M-PCR）又稱復合PCR，是指在一個PCR反應體系中加入2對或多對引物，能同時擴增出多個核酸片段，其反應原理、反應試劑和操作過程與單一PCR相同。與單一PCR相比，多重PCR利用選取位于不同染色體的標記進行組合，不僅可以檢測出親本自交種，同樣可以鑒定出摻雜其中的其他品種。另外，多重PCR也可以節約一定的時間和試劑用量。劉子記等[1]利用兩重PCR對西瓜品種進行純度鑒定，證明了雙重PCR可以有效提高檢測效率的可行性;吳明生等[7]利用三重引物進行擴增，促進了SSR技術在玉米種子純度中的應用;陳浩東等[8]最多利用4重PCR對雜交棉進行純度鑒定，奠定了棉花雜交種快速鑒定的基礎;胡倩梅等[9]利用多重PCR鑒定甜瓜種子，建議添加2對或3對標記進行多重PCR。目前，多重PCR應用在西瓜品種純度鑒定的研究報道較少。

筆者以小果型西瓜品種‘錦霞八號為研究對象，選取部分多態性引物，建立不同的引物組合，將三重PCR技術應用于西瓜雜交種的純度檢測，以期實現對西瓜品種快速而準確的純度鑒定。

1 材料和方法

1.1 材料

供試西瓜品種‘錦霞八號及其父母本由河南豫藝種業科技發展有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 將‘錦霞八號種子200粒，親本各5粒，采用溫湯浸種，將種子用55～60 ℃熱水浸泡10～15 min后，用KMnO4 5 000倍液常溫浸泡6～8 h。浸種后于恒溫培養箱中32 ℃左右催芽。分別放置育苗盤育苗。待幼苗子葉展平后進行采樣。

為保證DNA的質量以及擴增產物條帶的清晰度，利用改良CTAB法提取親本和雜交種的DNA。用微量核酸蛋白分析儀檢測DNA濃度及質量。

1.2.2 SSR引物多態性分析 在Zhu等[10]從西瓜全基因組開發的SSR引物中選出覆蓋西瓜全基因組的192對引物進行引物篩選和多態性分析。以‘錦霞八號親本為材料進行引物篩選，篩選出引物產物片段大小不同的標記，便于進行多重PCR擴增。

1.2.3 PCR擴增及聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 單一PCR反應體系及程序：PCR反應體系共10 ?L：模板1 ?L，引物1 ?L，Master Mix 5 ?L，ddH2O 3 ?L。PCR反應程序：預變性95 ℃ 5 min，變性94 ℃ 45 s，退火58～68 ℃ 1 min，8個循環，72 ℃ 1 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，20個循環，72 ℃ 1 min，72 ℃ 7 min，4 ℃保存。

多重PCR反應體系及程序：在單一PCR 10 ?L反應體系中加入2對或3對標記，調整ddH2O體積，其余成分與單一PCR擴增體系相同。反應程序與單一PCR相同。

PCR產物用6%（w）聚丙烯酰胺凝膠電泳90 min，使用銀染法染色[11]，觀察分析電泳結果。

1.2.4 比較SSR分子標記的純度鑒定結果與大田純度鑒定結果 根據PCR產物的電泳帶型，統計雜交種和非雜交種帶型的數量，計算雜交種純度。SSR鑒定品種純度/%=[（雜交種帶型的數量/總檢測數）]×100[12]。

田間純度鑒定結果由科研人員通過觀察株型、葉片、果形、果皮顏色等形態指標進行鑒定。最后將SSR純度鑒定結果與田間種植的鑒定結果進行比較分析。

2 結果與分析

2.1 SSR引物篩選結果

將覆蓋西瓜全基因組的192對引物在‘錦霞八號親本間進行多態性篩選，其中有36對引物在‘錦霞八號親本及F1之間具有多態性，多態性比率為18.8%（表1），分別位于西瓜第1、2、3、4、5、6、8、10、11號染色體。

2.2 SSR標記分組及多重PCR建立

根據表1中引物擴增片段的大小和多態性差異，選取位于不同染色體上的4對引物ClSSR03386（232 bp）、ClSSR04334（245 bp）、ClSSR0309843（132 bp）、ClSSR16601（197 bp）進行多重PCR分組及擴增。進行多重PCR組合時，以擴增片段相差至少大于35 bp進行分組，兩重PCR組：ClSSR03386和ClSSR09843，ClSSR04334和ClSSR09843;三重PCR組合：ClSSR03386、ClSSR09843、ClSSR16601。

2.3 ‘錦霞八號純度的鑒定

利用兩重PCR和三重PCR組合對200份‘錦霞八號雜交種進行純度鑒定。首先對兩重PCR組合進行擴增（圖1～2），電泳條帶明顯分布在2個區域，第一區域為引物ClSSR03386多態性片段分布區域，第二區域為引物ClSSR09843多態性片段分布區域。由圖1可知，引物ClSSR03386和引物ClSSR09843在200個單株中均能擴增出清晰條帶，且為父母本雜合帶型。

由圖3可知，同時對三重PCR組合進行擴增，電泳條帶明顯分布在3個區域，第1區域為引物ClSSR03386多態性片段分布區域，第2區域為引物ClSSR16601多態性片段分布區域，第3區域為引物ClSSR09843多態性片段分布區域。引物ClSSR03386、ClSSR16601和ClSSR09843均能擴增出條帶，且為父母本雜合帶型。

將兩重PCR結果與三重PCR結果進行對比分析，結果表明，利用兩重PCR和三重PCR對‘錦霞八號雜交種進行純度鑒定的結果完全一致，由此得出‘錦霞八號西瓜品種的純度為100%。

2.4 SSR標記與田間純度鑒定的比較

田間種植中，在果實發育期通過觀察株型、葉片、果形、果皮顏色等形態指標，對‘錦霞八號進行鑒定，其田間純度為98.8%。多重PCR鑒定結果與田間種植鑒定結果純度偏差為100%-98.8%=1.2%，符合純度鑒定中允許的誤差范圍（2%）。試驗結果說明，利用SSR標記可用于鑒定西瓜雜交種純度，而多重PCR可以快速而準確地鑒定西瓜雜交種純度，保證品種的真實性。

3 討論與結論

目前市場上銷售的西瓜種子均為雜交一代，種子純度是其質量的重要指標之一[13]。按照國家標準的規定，西瓜雜交品種的純度必須高于95%[14]。在人工生產種子的過程中，母本去雄不徹底、機械混雜和生物學混雜等原因都會降低種子純度。綜合前人對西瓜品種純度鑒定的研究，多數研究者利用單一的PCR擴增確定品種的真實性，雖然可以區分出親本自交種，但對品種間的機械混雜鑒定存在局限性。前人證實了SSR分子標記技術的可行性[15]。孫波等[6]利用23對SSR核心引物對西瓜品種進行純度鑒定，其結果充分說明了SSR分子標記鑒定品種純度的可靠性。張佩倫等[16]利用SSR標記對4個西瓜品種進行純度鑒定，其結果與田間形態學鑒定結果高度一致。利用單一引物進行雜交種純度鑒定時，多數研究者大多采取熱堿法、SDS法等快速提取植物基因組DNA的方法;但是利用多重PCR進行鑒定時多數研究者則是采取CTAB法提取DNA[17-18];常宏等[19]在對玉米種子真實性的鑒定中得出，相比較CTAB法和熱減法提取的DNA，CTAB法提取的DNA質量較高，且電泳結果主帶較清晰;而熱減法提取的DNA質量較差，主帶出現嚴重拖尾。胡倩梅等[9]利用堿裂法提取甜瓜葉片DNA，構建多重PCR體系，發現利用4對引物同時進行擴增時會影響判斷條帶的準確性，添加2對和3對引物可以準確判斷引物擴增出的條帶。所以，對于粗提DNA的方法是否可以應用到多重PCR鑒定西瓜純度，有待于進一步研究。

筆者通過對覆蓋西瓜全基因組的192對引物進行篩選，36對引物在‘錦霞八號及其親本之間具有多態性，多態性比率為18.8%，從中選擇4對位于西瓜不同染色體上的SSR標記檢測‘錦霞八號純度。通過構建雙重和三重PCR體系，對‘錦霞八號雜交種進行純度鑒定，雙重PCR結果和三重PCR結果基本吻合。分子鑒定結果與田間鑒定結果高度一致，與前人研究結論一致。利用SSR分子標記技術對西瓜雜交種進行純度鑒定，將結果與田間形態學鑒定的結果對比，兩者純度偏差為1.2%，符合允許的誤差范圍（2%）。

筆者利用多對特異性引物建立多重PCR體系進行純度鑒定，同時驗證品種的真實性和種子純度，過程快速方便、結果準確可靠，本研究結果也對西瓜雜交種利用多重PCR進行純度鑒定的相關研究提供一定的參考。

參考文獻

[1]? 劉子記，詹園鳳，朱婕，等.利用 SSR 標記鑒定西瓜雜交種純度的研究[J].熱帶作物學報，2016，37（9）：1714-1718.

[2]? 馬雙武，韋小敏，王吉明.我國西瓜雜交種子純度鑒定方法綜述[J].長江蔬菜，2006（10）：27-30.

[3]? 譚美蓮，嚴明芳，汪磊，等.蓖麻雜交種的 SSR 鑒定及遺傳變異分析[J].西北植物學報，2012，32（8）：1539-1546.

[4]? TAUTZ D，RENZ M. Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes[J]. Nucleic Acids Research，1984，12（10）：4127-4138.

[5]? 何琳，王群.基于PCR的SSR標記分離方法綜述[J].基因組學與應用生物學，2010，29（4）：775-782.

[6]? 孫波，鄒甜，王志偉，等.利用 SSR 技術鑒定西瓜品種純度[J].中國瓜菜，2018，31（6）：16-19.

[7]? 吳明生，賈希海，律寶春，等.多重引物 SSR 技術鑒定玉米雜交種子純度的研究[J].玉米科學，2006，14（50）：38-40.

[8]? 陳浩東，劉方，王為，等.棉花多重 PCR 技術及其對雜交棉純度鑒定的初步研究[J].棉花學報，2011，23（1）：22-27.

[9]? 胡倩梅，王躍君，楊世超，等.多重PCR在甜瓜種子純度鑒定中的應用[J].分子植物育種，2019，17（12）：4000-4006.

[10] ZHU H，SONG P，KOO D H，et al.Genome wide characterization of simple sequence repeats in watermelon genome and their application in comparative mapping and genetic diversity analysis[J].BMC Genomics，2016，17（1）：557.

[11] 李其松，王金玉，沈華，等.DNA 聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染方法的探討[J].黑龍江畜牧獸醫，2006（10）：79-80

[12] 李超漢，劉莉，劉翔，等.基于SSR標記的5個西瓜新品種純度鑒定及特異性分析的研究[J].中國農學通報，2015，31（33）：177-185.

[13] 牛茜，田雅欄，吳明生.SSR分子標記技術在西瓜品種純度快速鑒定中的應用研究[J].種子科技，2014（7）：37-38.

[14] 張衛民，張順東.西瓜種子純度種植鑒定技術[J].新疆農業科技，2003（3）：20.

[15] 蔣莉莉，張高原，張建農.西瓜雜交組合T-1種子純度鑒定的SSR 標記研究 [J].西北農林科技大學學報（自然科學版），2016，44（6）：93-98.

[16] 張佩倫，郭祿芹，胡倩梅，等.利用SSR標記快速鑒定西瓜雜交種純度[J].中國瓜菜，2018，31（5）：16-19.

[17] 李重，胡偉明，楊天順，等.用于枸杞品種鑒定的多重EST-SSR標記的建立[J].分子植物育種，2017，15（10）4066-4070.

[18] 譚君，張彪，唐海濤，等.利用多重PCR技術鑒定玉米品種的初步研究[J].西南農業學報，2010，23（4）1028-1031.

[19] 常宏，王漢寧，張金文，等.玉米品種真實性和純度鑒定的SSR標記多重PCR體系優化[J].草業學報，2010，19（2）：204-211.