葉酸的檢測方法

王娜娜

摘要：目前已經(jīng)發(fā)展的一些葉酸檢測的方法各不相同，主要根據(jù)測定式樣來決定其測定方法，最早發(fā)展的是微生物法，靈敏度高，但重復性相對較差，主要有比色法、紫外分光光度法、熒光分析法等等。

關鍵詞：葉酸 檢測 方法

微生物法

微生物法的檢測原理為酪乳酸桿菌的生長必需葉酸，培養(yǎng)基中若缺乏葉酸則該細菌不能生長。在一定的條件下，酪乳酸桿菌的生長及其代謝產(chǎn)物的濃度與培養(yǎng)基中葉酸的含量成正比關系，可測定細菌代謝物或菌體的濃度，即用酸度或渾濁度測定試樣中葉酸的含量。

熒光法

超聲氧化熒光法

葉酸自身熒光很弱，在中性介質(zhì)中經(jīng)超聲照射后，能被氧化成喋呤羧酸，其熒光強度在462 nm波長處比葉酸自身有顯著提高。基于以上現(xiàn)象，建立了一種超聲氧化預處理，熒光檢測葉酸的方法。

熒光分光光度法

本法利用高錳酸鉀在酸性介質(zhì)中氧化葉酸為1-氨基-4-羥基喋吮-6-葉酸后，其熒光強度可以測定復方制劑中葉酸的含量，其他維生素可用硅藻土吸附除去，本法靈敏度較高，可測得0. l ug/ml的葉酸。

衍生熒光法

在酸性條件下，用強氧化劑氧化葉酸，并于254 nm紫外光下照射30 min，其氧化產(chǎn)物均具有強的熒光性質(zhì)，因此熒光強度大大增強，比葉酸自身靈敏度提高2-3個數(shù)量級。實驗結果表明：高錳酸鉀氧化一光照體系檢出限為3.2 x10 -9mol/L，過氧化氫氧化一光照體系檢出限為6. 5 x 10 -9mol/L。

離子捕獲法

1995年，wilson等提出了離子捕獲法檢測葉酸。即在實驗中，樣品中加入變性劑后，葉酸與內(nèi)源性結合蛋白分離，釋放后的葉酸再與帶有大量陰離子的親合試劑結合，合成產(chǎn)物經(jīng)過離子捕獲池而與陽離子纖維結合，最后通過堿性磷酸酶與喋酸（葉酸的類似物）結合物對葉酸結合蛋白上游離結合位點的探測，定量分析樣品中葉酸的含量。

色譜法

高效液相色譜法

在薄膜強陰離子交換樹脂 （0.01 *300cm pellicular）柱上用氯化鉀一磷酸鹽緩沖液（pH = 7.5）在40℃的溫度下進行梯度洗脫，可將三經(jīng)基葉酸（THF） ， N5-甲基一三經(jīng)基葉酸（N5-CH3， -THF），去氫葉酸（DHF）、葉酸（FA）等異構體的混合物分離，洗脫的順序是：THF， N5- CH3 -THF， DHF， FA。

薄層色譜法

采用過渡金屬Mn2+ 、Fe2+ 、Co2+ 、Ni2+ 、Cu2+ 、Cd2+ 、Zn2+ 或Hg2+ 浸漬的硅膠G 薄層板，以正丙醇+正丁醇+水+氨（ 7+ 5+ 1+ 2） 為展開劑，可以對維生素B 1 、B 2 、B 6 、B 12 和蝶酰谷氨酸（ FA） 進行分離 。采用高效纖維素薄層板，以異丙醇和檸檬酸緩沖溶液為展開劑， 采用紫外和熒光檢測， 可以測定亞葉酸鈣制劑中0. 1%的FA、10-甲酰基二氫葉酸（ 10-CHO-DHF） 等雜質(zhì) 。

氣相色譜法

有人采用阿拉伯糖乳桿菌合成13C標記的葉酸，并以此為內(nèi)標，與血液或組織樣品混和，與過量的葉酸結合蛋白結合，除去對氨基苯甲酸多谷氨酸，然后用6mo1/ L HC1將葉酸分解成對氨基苯甲酸（PABA）、蝶陡和谷氨酸，采用氣質(zhì)聯(lián)用技術測定PABA。

比色法

茚三酮比色法

本法主要適用于測定藥劑中的葉酸，采用1， 2萘并喳琳-4磺酸鈉將葉酸還原生成對氨基苯谷氨酸，在485nm處有最大吸收峰。現(xiàn)已改為用鋅粉和鹽酸將葉酸還原為2， 4， 5-三胺基-羥基嘧啶。經(jīng)實驗證明，TAHP中的5位胺基及6位羥基參加和茚三酮生色反應，該紫色化合物在555nm處有最大吸收峰。

還原裂解比色法

本法也適用于測定藥物中葉酸的含量，其原理是基于將葉酸還原裂解為2-氨基-4-羥基-6-甲基喋啶和對氨基苯甲酰谷氨酸，后者經(jīng)重氮化后與N-（1-N）-二乙二胺偶合形成紫紅色的偶氮化合物，550nm波長處有最大吸收峰。

直接比色法

本法適用于測定純品葉酸。原理為葉酸與Folin一cioalten試劑作用（室溫，堿性介質(zhì)中）產(chǎn)生藍色，在760nm處有最大吸收峰。在4.4 – 44ug/ml濃度范圍內(nèi)符合Beer定律，顏色可穩(wěn)定90min，葉酸的分解產(chǎn)物對氨基苯甲酞谷氨酸與F-C試劑產(chǎn)生藍色。

紫外分光光度法

本法只適用于純?nèi)~酸藥劑及針劑的測定。測定原理為葉酸在0.1 mol/L氫氧化鈉中具有最大吸收作用在260nm處和283nm處葉酸的最大吸收可用于定量分析葉酸含量。

電化學方法

利用葉酸分子在汞電極上的吸附性，采用在適當電位預富集的方法與示差脈沖結合，建立了測定痕量葉酸的電化學分析方法。

高效液相柱后衍生法

高效液相柱后衍生法的特點是操作簡單、快捷、靈敏，滿足日常分析。市疾病預防控制中心劉莉治等人采用該法測定出了嬰兒保健食品中葉酸的含量，他們在實驗中選用了含12%乙腈+88% 0.05 mmol/LKH2PO4溶液（pH=3.5）作為流動，使用熒光檢測器檢測定量，激發(fā)波長為365 nm，發(fā)射波長為450 nm，并用外標法測定了葉酸的含量。

單掃描示波極譜法

單掃描示波極譜法的特點是操作簡單，不需要昂貴的儀器設備。集美大學的彭愛紅等人 采用JP-303型極譜分析儀測定葉酸，建立了保健食品中葉酸的單掃描二階導數(shù)示波極譜測定方法，并用正交試驗確定了葉酸測定的最佳底液條件。

參考文獻：

[1]方尚玲. 葉酸及其檢測[J]. 武漢輕工大學學報， 2000（1）