健脾疏肝降脂方干預(yù)非酒精性脂肪肝病肥胖小鼠肝功能、游離脂肪酸機(jī)制探討*

巴明玉，婁永強(qiáng)，祿保平

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(鄭州450000)；2.河南省通許縣中醫(yī)院(通許 475400)； 3.河南中醫(yī)藥大學(xué)(鄭州 450046)

非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)在一定程度上是可逆的，肥胖病患者在進(jìn)行減肥手術(shù)后肝脂肪變能夠得到好轉(zhuǎn)，由此可見(jiàn)，肥胖與非酒精性脂肪肝病的發(fā)病關(guān)系密切[1-2]。導(dǎo)師祿保平教授從中醫(yī)基本理論入手，結(jié)合歷代醫(yī)家的臨證經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)出的健脾疏肝降脂方治療非酒精性脂肪肝效果顯著?，F(xiàn)筆者就此方對(duì)NAFLD肥胖小鼠ALT、AST、游離脂肪酸(Free fatty acid，F(xiàn)FA)及光鏡下病理組織學(xué)的影響作一實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

1 藥 物 健脾疏肝降脂方購(gòu)買(mǎi)及鑒定均符合國(guó)家《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)按要求配制成相應(yīng)濃度藥液。藥物對(duì)照組所用殼脂膠囊(批號(hào)：Z20050665)，配成混懸液備用；四氯化碳：濟(jì)寧恒泰化工有限公司(批號(hào)：20130904)；0.9%氯化鈉注射液：廣州市昕迪實(shí)驗(yàn)器材有限公司(批號(hào)：20140614)；5%的CCl4食用油溶液：(四氯化碳∶玉米油=5∶95，V/V)混合液。

2 試劑和儀器 游離脂肪酸(FFA)試劑盒(批號(hào)：20140617)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒(批號(hào)：20140817)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒(批號(hào)：20140817)均有青島雅各化學(xué)試劑銷(xiāo)售有限公司提供；全自動(dòng)生化分析儀、CX31-32C02光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS株式會(huì)社)；石蠟切片機(jī)、LEICA切片機(jī)、攤片機(jī)、烘片機(jī)(德國(guó)萊卡公司)；伯樂(lè)680全自動(dòng)酶標(biāo)儀(北京伯樂(lè)生命科學(xué)發(fā)展有限公司)。

3 動(dòng)物分組 健康SPF級(jí)小鼠72只，隨機(jī)分為空白組，模型對(duì)照組，殼脂膠囊組，健脾疏肝降脂方高、中、低劑量組。除空白組外，其余各組均以髙脂飼料(79.8%基礎(chǔ)飼料、18%豬油、2%膽固醇和0.2%的丙基硫氧嘧啶)喂養(yǎng)6周，6周后除空白組外，其余各組均用CCl4注射法建立非酒精性脂肪肝模型。實(shí)驗(yàn)方法參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[3]。

4 給藥方法及途徑 殼脂膠囊組按0.5 g/(kg·d)殼脂膠囊藥液；健脾舒肝降脂方高、中、低劑量組分別給予80、40、20 g/(kg·d)健脾舒肝降脂方藥液[4]；空白組及模型組均給予等容量的生理鹽水灌胃。每天1次，連續(xù)灌胃6周，每周測(cè)量小鼠體重并記錄。

5 一般指標(biāo)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)6周末，最后1次給藥后對(duì)小鼠禁飲食及水12 h后，采血測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，并采取肝組織勻漿檢測(cè)游離脂肪酸(FFA)。

6 光鏡觀察 小鼠處死后，迅即剖腹取出肝臟，新鮮肝臟組織用4%的多聚甲醛溶液固定常規(guī)石蠟包埋切片，常規(guī)脫蠟及脫水，常規(guī)石蠟包埋、切片，然后進(jìn)行HE染色，梯度酒精脫水，中性樹(shù)膠封片，放置1周，待膠片干后光鏡下觀察肝組織的脂肪變程度。

結(jié) 果

1 健脾疏肝降脂方對(duì)小鼠肝功能的影響 藥物干預(yù)6周后，中藥各個(gè)濃度組相比殼脂膠囊組更能明顯降低血清 ALT、AST，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其藥物治療組與模型組相比均可以明顯降低血清 ALT、AST，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 藥物對(duì)各組小鼠血清ALT、AST 水平的影響(U/L)

注：與空白組相比，△P<0.05，*P<0.01；與模型組相比，#P<0.01

2 健脾疏肝降脂方對(duì)小鼠肝組織FFA的影響 藥物干預(yù)6周后，治療高、中劑量組 FFA 降低，與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但高、中劑量組相比殼脂膠囊組效果相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可以看出，在降低FFA方面，高、中劑量組效果較好。見(jiàn)表2。

表2 藥物對(duì)各組小鼠肝組織 FFA 的影響(μmol/gprot)

注： 與正常組相比，△P<0.05；與模型組相比，▲P<0.05

3 光鏡下肝組織病理組織學(xué)觀察 空白組：鏡下見(jiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，排列均勻；無(wú)脂肪變性及壞死，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型對(duì)照組小鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，可見(jiàn)肝組織呈彌漫性脂肪變性，細(xì)胞內(nèi)單個(gè)大脂滴將細(xì)胞核擠向細(xì)胞膜，有時(shí)可見(jiàn)由2個(gè)及2個(gè)以上的破裂肝細(xì)胞融合，呈“氣球樣”改變。各用藥組小鼠的肝小葉脂肪變肝細(xì)胞數(shù)目均減少。用藥組中、高劑量組相對(duì)低劑量組及殼脂膠囊組細(xì)胞內(nèi)胞漿豐富，胞質(zhì)內(nèi)脂滴減少或消失，細(xì)胞核大小正常，位置居中，肝細(xì)胞脂肪變性程度得到很大改善。

討 論

ALT、AST屬于肝細(xì)胞合成的常見(jiàn)酶之一，可有效維持機(jī)體正常的生理活動(dòng)，是機(jī)體進(jìn)行物質(zhì)代謝的必要物質(zhì)之一，有研究證實(shí)，肝臟中含有大量的酶，但當(dāng)肝功能出現(xiàn)異常情況時(shí)，肝細(xì)胞的細(xì)胞通透性出現(xiàn)不同程度的改變，易導(dǎo)致酶從肝細(xì)胞內(nèi)大量釋放至血液中，引起血清相關(guān)酶水平出現(xiàn)不同程度的變化，因此，可將血清酶水平作為評(píng)價(jià)肝細(xì)胞受損的有效指標(biāo)之一，而ALT、AST具有較高的敏感性和特異性，所以可將其作為診斷、評(píng)估脂肪肝的指標(biāo)之一[5]。另外脂代謝紊亂及胰島素抵抗(IR)也是NAFLD的主要致病機(jī)制之一，脂質(zhì)沉積，即肝臟獲取的游離脂肪酸(Free fatty acid，F(xiàn)FA)超過(guò)肝臟自身處理能力(β氧化能力)，導(dǎo)致甘油三酯淤積[6]。游離脂肪酸對(duì)非酒精性脂肪肝影響是多重的，同脂肪變性、肝組織炎癥以及其纖維化等病變相關(guān)[7]。FFA過(guò)高可啟動(dòng)氧化應(yīng)激機(jī)制，激活多種信號(hào)通路導(dǎo)致IR，IR又可降低胰島素抑制脂肪酶的活性，使外周組織脂肪分解增多，F(xiàn)FA水平增高[8]。而血清中FFA過(guò)多，被肝細(xì)胞大量攝取后將導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性，形成NAFLD[9]。因此，檢測(cè)血清中AST、ALT含量及游離脂肪酸水平可以作為評(píng)價(jià)藥物治療非酒精性脂肪肝的重要參考依據(jù)。

肥胖合并NAFLD多因平素嗜食肥甘之品，脾失健運(yùn)，痰濁內(nèi)生，血脈瘀滯，痰瘀互相搏結(jié)而形成，病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛以脾為主，標(biāo)實(shí)主要為痰濕、血瘀；脾氣虛津液不能四布，則津液不足；脾虛不能運(yùn)化水谷精微，則生痰濕，阻滯氣機(jī)成瘀。結(jié)合其病機(jī)特點(diǎn)，導(dǎo)師祿保平教授通過(guò)中醫(yī)辨證結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)自擬了健脾疏肝降脂方(由黨參、茯苓、白術(shù)、橘紅、柴胡、郁金、虎杖、荷葉、決明子、山楂、炙甘草等藥物組成)，臨床已取得顯著的治療效果。現(xiàn)代藥理研究表明，黨參、白術(shù)、茯苓均有護(hù)肝、保護(hù)肝功能的作用[10-12]。本方中山楂、荷葉、決明子臨床應(yīng)用及現(xiàn)代研究都有很好的降脂減重作用[13-15]。綜觀全方，補(bǔ)中兼泄，體現(xiàn)了健脾不忘疏肝，扶正不忘祛濕的原則，共達(dá)肝體得養(yǎng)，肝用得暢，邪去正安的目的，因此本方充分體現(xiàn)了中醫(yī)辨證論治的基本理論與現(xiàn)代研究的完美結(jié)合。

經(jīng)過(guò)6周治療，藥物治療組均可以明顯降低血清ALT、AST，中藥各個(gè)濃度組相比殼脂膠囊組更能明顯降低血清ALT、AST，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；由此可以看出此方在降低小鼠血清ALT、AST方面與藥物劑量無(wú)明顯關(guān)系；但此方在改善FFA方面，高、中劑量組相比殼脂膠囊組效果相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合病理學(xué)觀察顯示，相對(duì)于低劑量組及殼脂膠囊組，健脾疏肝降脂方中、高劑量組細(xì)胞內(nèi)胞漿豐富，胞質(zhì)內(nèi)脂滴減少或消失，細(xì)胞核大小正常，位置居中，肝細(xì)胞脂肪變性程度得到很大改善。由此可以看出，健脾疏肝降脂方可以明顯改善NAFLD肥胖小鼠的肝功能、FFA，并且病理結(jié)果也支持其效果與藥物濃度存在關(guān)系。