微孔板法在一線抗結核藥物敏感性試驗中的應用價值

楊翰 楊靜芬 伍浩 崔曉利 黨麗云

結核病是由結核分枝桿菌引起的多器官受損的傳染病，主要以肺結核為主。藥物化療是其主要治療方式，但因近年來耐藥結核病的發生率不斷上升，使結核病的防治異常嚴峻。WHO[1]發布的《2019全球結核病報告》指出，2018年全球共有186 772例耐多藥及利福平耐藥結核病(multidrug- and rifampicin-resistant tuberculosis，MDR/RR-TB)患者，明顯高于2017年(160 684例)。因此，藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)在結核病的治療中起到了至關重要的作用。目前，臨床檢測結核病耐藥性的主要方法包括分子藥敏試驗及表型藥敏試驗，盡管WHO推薦表型藥敏試驗中的比例法與BACTEC MGIT 960液體培養(簡稱“MGIT 960” 法)，但由于比例法培養時間長，MGIT 960法檢測藥物種類較少，使得可大大提升檢測藥物種類及明顯縮短報告時間的微孔板法被廣泛應用[2-6]，但其檢測結果的可靠性仍需大量臨床研究進行驗證。本研究以MGIT 960法為標準，分析微孔板法藥敏試驗對鏈霉素(Sm)、異煙肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)等4種一線抗結核藥物檢測的符合率、一致性等指標，為微孔板法藥敏試驗的臨床意義及價值提供參考依據。

材料和方法

一、材料收集

收集2019年1—6月西安市胸科醫院收治的經MGIT 960法培養陽性的1086份標本，選擇其中經菌種鑒定為結核分枝桿菌且同時對鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇行MGIT 960 法和微孔板法藥敏試驗的331份菌液，分析兩種試驗方法的檢測情況；并以MGIT 960法為標準，評估微孔板法藥敏試驗的檢測效能，對結果不一致的菌液以熔解曲線法檢測耐藥基因予以核實。

二、研究方法

1.儀器與試劑：Lad-Aid 824s 核酸提取儀(廈門致善生物科技有限公司)，SLAN系列實時熒光定量PCR檢測系統(廈門致善生物科技有限公司)，YK-009 自動加樣系統(珠海銀科醫學工程股份有限公司)，BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌培養及藥敏檢測系統(美國BD公司)，結核分枝桿菌耐藥基因突變檢測試劑盒(鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇，批號 19012101；廈門致善生物科技有限公司)，Lad-Aid 824結核分枝桿菌核酸提取Maxi試劑(批號190111，廈門致善生物科技有限公司；為PCR體系中的引物、dNTP、Mg2+等物質，本研究有MixA、MixB)，MGIT 960 液體藥敏試劑盒(批號：804944；美國BD公司)，分枝桿菌藥敏檢測試劑盒(批號：19011002，珠海銀科醫學工程股份有限公司)。

2.MGIT 960 法藥敏試驗的操作方法[7]：(1)菌液準備：取MGIT 960系統報告陽性且菌種鑒定為結核分枝桿菌的菌液，以報告陽性當天記為第0天，若在第1、2天可直接進行工作菌液藥敏試驗接種，若在第3～5天則需用滅菌生理鹽水按照1∶5(1 ml菌懸液、4 ml生理鹽水)稀釋后的工作菌液進行藥敏試驗接種。(2)含藥培養基準備：于MGIT 960試劑盒取5只培養管，第1管標記GC(空白對照)，其余4管分別標記為Sm(1 μg/ml)、INH(0.1 μg/ml)、RFP(1 μg/ml)、EMB(5 μg/ml)。無菌操作下每管加入0.8 ml增菌劑，在相應含藥標記管加入100 μl相應藥物干粉，并以4 ml滅菌蒸餾水溶解；空白對照管內加入0.5 ml的1∶100倍稀釋的工作菌液(0.1 ml菌液、10 ml滅菌生理鹽水)，其余4管含藥培養基也加入上述工作菌液0.5 ml，蓋緊螺旋蓋并混勻。(3)結果報告：將上述培養管放入MGIT 960系統內培養，等待機器報告結果。

3.微孔板法藥敏試驗的操作方法[8]：備好藥敏試驗對應菌株和試劑，使用超聲分散儀將菌液磨菌比濁至1 mg/ml，取出凍干雜菌抑制劑，將無菌稀釋液全部加入后混勻，取出陰性對照管和藥敏培養基放置至接近室溫，用加樣槍分別吸取30 μl抑制劑加入陰性對照管中，吸取100 μl抑制劑加入藥敏培養基中，用加樣槍吸取菌液100 μl加入藥敏培養基后上機，儀器加樣完成后取出藥敏測試板，蓋上蓋子，用透明膠帶沿周邊封1圈后置于37 ℃培養箱中培養，10～21 d內觀察結果。微孔板藥敏試驗中4種藥品的耐藥濃度分別為鏈霉素：中敏4 μg/ml，耐藥8 μg/ml；異煙肼：耐藥2 μg/ml；利福平：中敏 4 μg/ml，耐藥8 μg/ml；乙胺丁醇：中敏2.5 μg/ml，耐藥5 μg/ml。

4. 熔解曲線法的操作方法：(1)核酸提取：吸取MGIT 960法報告陽性菌液750 μl至1.5 ml EP管中，99 ℃金屬浴15 min。按照Lad-Aid 824結核分枝桿菌核酸提取試劑盒說明書進行操作，將獲得的DNA溶液以12 000×g離心1 min，收集上清液用于后續試驗。(2)試劑配制：取出保存在-20 ℃的相應藥物試劑盒平衡至室溫，將MixA、MixB渦旋振蕩充分混勻，分別吸取19.6 μl MixA、MixB，與0.4 μl酶液(含反轉錄酶、T7聚合酶)混合后加入0.2 ml離心管中。在相應0.2 ml離心管中加入5 μl 提取的DNA上清液，瞬時離心，彈去氣泡，上機檢測。(3)結果判讀及分析。

三、統計學處理

采用SPSS 18.0軟件進行數據的統計學分析。以MGIT 960法為金標準，計算微孔板法對鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇等4種藥品的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、符合率及Kappa值，其中Kappa值在0.00～0.20為極低一致性，0.21～0.40為一般一致性，0.41～0.60為中等一致性，0.61～0.80為高度一致性，0.81～1.00為幾乎完全一致[9-10]。

結 果

一、微孔板法檢測結果

兩種方法的檢測結果為耐藥、中敏及敏感，本結果中的“中敏”納入“敏感”計算檢測效能。以MGIT 960法為標準，對4種藥品檢測的符合率均在97%以上；除乙胺丁醇的敏感度為66.7%，其他3種藥品間的敏感度、特異度、陰性預測值、陽性預測值均較高。一致性檢測中，除乙胺丁醇的Kappa值(0.72)為“高度一致性”外，鏈霉素、異煙肼、利福平等3種藥品的Kappa值(分別為0.93、0.94、0.95)均為“幾乎完全一致”。

表1 以MGIT 960法為標準分析微孔板法對4種一線抗結核藥品的耐藥性檢測效能

表2 兩種藥敏試驗不一致結果與熔解曲線結果對比分析

二、微孔板法與MGIT 960法的不同結果分析

微孔板法與MGIT 960法檢測4種藥品均一致的耐藥性結果(包括敏感或耐藥)分別為鏈霉素321份(97.0%)，異煙肼323份(97.6%)，利福平325份(98.2%)，乙胺丁醇315份(95.2%)。兩者結果不一致(包含微孔板法的“中敏”結果)主要集中在MGIT 960法為耐藥而微孔板法為敏感或中敏(33份)，見表2。經熔解曲線耐藥基因分析后結果顯示，微孔板法為中敏而MGIT 960法為耐藥者10份(3.0%，10/331)，耐藥基因均為突變；而微孔板法為中敏而MGIT 960法為敏感僅1份(0.3%，1/331)，且耐藥基因為突變；微孔板法為敏感而MGIT 960法為耐藥者23份(6.9%，23/331)，耐藥基因為鏈霉素和異煙肼以野生型較多(分別為6/8，4/5)，利福平和乙胺丁醇以突變型較多(分別為3/3，7/7)，具體見表2。

討 論

目前，結核分枝桿菌表型藥敏試驗的方法以WHO推薦的比例法及MGIT 960法為主。日常開展實驗室工作中，比例法操作較為復雜，單個樣本的檢測耗時長，操作人員往往對大樣本量處理較為困難，且結果報告需要4周；MGIT 960法操作較為簡單，結果報告時間短，但對菌液的濁度較難控制，容易造成假陰性結果[8]，且目前僅對一線抗結核藥物應用較多。故為了適應臨床需求，多種微孔板法藥敏檢測試劑盒被不斷推出，較為成熟的有賽默飛世爾科技有限公司(Thermo Fisher Scientific)、珠海銀科醫學工程股份有限公司、鄭州安圖生物工程股份有限公司等生產的試劑盒，本研究僅采用珠海銀科醫學工程股份有限公司分枝桿菌微孔板法藥敏檢測試劑盒(培養法)，該試劑盒可檢測16種一、二線抗結核藥物，其中4種一線藥物各4個藥物梯度，12種二線藥物各2個藥物梯度(中敏與耐藥MIC濃度)。與MGIT 960法相比，微孔板法是將被檢測藥物提前包被在96孔板中，由操作人員或自動移液平臺將定量的菌懸液接種到96孔板中即可，操作較為簡便，而MGIT 960法需要人工配置藥物到培養管中，增加了操作程序以及污染風險。

微孔板法作為“十一五”國家科技重大專項的科研轉化成果，能夠更快速、更簡便的檢測出4種一線抗結核藥物和12種二線抗結核藥物的藥敏試驗結果，有利于早期篩查耐藥性。蘇碧儀等[11]報道了微孔板法在部分二線抗結核藥物中的較高應用價值，與MGIT 960法具有較高的符合度，其檢測異煙肼、利福平耐藥性的敏感度和特異度與傳統的比例法也有較高一致性，且與耐藥基因相關檢測也有較高符合率。本研究以MGIT 960法為標準對比了微孔板法對一線抗結核藥物耐藥性檢測的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、符合率、Kappa值等指標，結果顯示微孔板法檢測4種一線抗結核藥物耐藥性具有較好的敏感度、特異度，且與MGIT 960法一致率較高，可以滿足臨床應用，且兩種方法不一致結果主要為MGIT 960法為耐藥但微孔板法為中敏或敏感，提示微孔板法較MGIT 960法可以檢測出低濃度耐藥的情況。過去的研究發現，MGIT 960法確定的敏感菌株會存在部分基因突變，表現為這部分患者一線抗結核藥物的治療效果較差，為避免過早放棄使用異煙肼、利福平等核心一線藥物，可以利用微孔板法發現低濃度耐藥的作用，為臨床藥物的使用劑量提供參考[12-13]。進一步經熔解曲線法核查耐藥基因，發現當微孔板法為“中敏”時耐藥基因為突變型；當微孔板法為“敏感”時，鏈霉素與異煙肼的耐藥基因多為野生型，而利福平與乙胺丁醇的耐藥基因則全部為突變型。但通過對耐藥基因的核查，提示當使用不同表型藥敏試驗方法檢測時，如果出現與耐藥基因結果不一致，應進一步復查表型藥敏檢測為敏感而耐藥基因為突變的菌液，以明確表型藥敏試驗的結果是否可靠。

針對本研究的檢測結果，筆者認為可能存在以下不足：(1)本研究采用的試劑盒可報告MIC值，但與抗生素藥品的最低抑菌濃度檢測法(MIC法)有所區別，在一線抗結核藥物中有4個藥物梯度，二線抗結核藥物僅有中敏與耐藥2個藥物濃度值且不連續，因此在報告二線藥物時僅為參考性最終結論，不能以報告的MIC值判斷藥物的抑菌濃度。(2)微孔板法操作需要嚴格無菌操作，若出現單孔污染時應當分析是否影響整體試驗結果，特別是在二線藥物僅有2個藥物梯度的前提下，隨機的單孔污染都應當進行復檢來保證結果的可靠性。(3)本研究采用的試劑盒配備的藥敏判讀軟件，在正常輸入結果后，儀器判讀的MIC值為細菌生長的藥物濃度最高孔，而非最低抑菌濃度孔，實驗室操作人員應注意判讀標準，以避免發布錯誤報告，影響患者治療。(4)在檢測過程中，出現部分96孔板孔序倒置的問題，例如：原A、B列的陽性對照孔出現在K、L列(該藥敏板在生產時存在孔序倒置問題)，表明此次試驗失敗，需重新進行藥敏試驗。

綜上所述，微孔板法藥敏試驗對一線抗結核藥物的檢測與MGIT 960法具有較高的一致性，可基本滿足臨床需求，但實驗室操作人員需嚴格把控檢測試劑盒的質量以及結果審核，避免出現錯誤報告。