背角無齒蚌超氧化物歧化酶基因的克隆及多溴聯(lián)苯醚-47和多溴聯(lián)苯醚-209對其表達的影響

陳佳煒，邵向陽，黃天科，李媛，張龍慧，董艷美，王夢琪，張科，齊金旭，夏西超，邱茂林

平頂山學院醫(yī)學院，平頂山 476000

多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)是一類廣泛應用于電子設備、塑料、紡織品和建筑材料中的阻燃劑，已被列入具有生態(tài)風險性的持久性有機污染物[1-2]。隨其應用不斷增加，PBDEs在環(huán)境中呈現(xiàn)持久性累積和生物體內大量蓄積的趨勢，已成為威脅淡水生物的重要有機污染物[3]。PBDEs很難被環(huán)境中微生物所降解，容易在脂肪組織中累積下來，并且隨整個食物鏈出現(xiàn)放大效應[3]。PBDEs在生物體中能夠催化活性氧(ROS)生成，干擾線粒體呼吸作用，導致ROS過量生成，三磷酸腺苷(ATP)合成減少，最終導致細胞死亡[3]。在PBDEs家族中，PBDE-47和PBDE-209應用較為廣泛，在鰻鱺(Anguillajaponica)、海鱒(Salmotrutta)和貽貝(Mytilusedulis)等多種水生生物中被廣泛檢測到[4]。

超氧化物歧化酶(SOD)是生物機體防御過氧化損傷系統(tǒng)的關鍵酶之一，將氧自由基快速歧化為普通分子氧和過氧化氫，是一類敏感的分子生態(tài)毒理學指標[5]。按其所含金屬輔基不同，SOD可分為銅/鋅SOD(Cu/ZnSOD)、錳SOD(MnSOD)、鐵SOD(FeSOD)和鎳SOD(NiSOD)[6]。Cu/ZnSOD和MnSOD主要存在于原核生物、甲殼動物、魚類和哺乳動物，其中，Cu/ZnSOD與機體正常生理功能實現(xiàn)和疾病發(fā)生有密切關系，也是為揭示機體氧化應激過程而研究最多的一種酶[7]。Cu/ZnSODmRNA表達和酶活性常被用作環(huán)境污染潛在標志物，尤其對重金屬、殺蟲劑和持久性有機污染物等環(huán)境應激改變比較敏感[8-9]。

雙殼類是軟體動物一個重要類群，常年棲息在海洋、河流和湖泊底部，以濾食生活為主，是檢測環(huán)境污染的重要生物標志物[10-11]。相對于海洋雙殼類動物而言，淡水貝類用于環(huán)境檢測和毒理學研究的步伐較為滯后。背角無齒蚌是雙殼類軟體動物主要成員之一，在多氯酚、重金屬和多氟烷基化合物等檢測中發(fā)揮積極作用，常作為淡水污染的指示性生物[12-13]。為了更好揭示PBDEs環(huán)境毒性，保護淡水資源和淡水生物，本研究以背角無齒蚌(Anodontawoodiana)為研究對象，克隆出AwSOD全基因序列，分析PBDE-47和PBDE-209對AwSOD時空表達的影響，為揭示PBDEs毒理效應提供理論參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

背角無齒蚌購自南陽市水產市場，PBDE-47、PBDE-209和二甲亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)購自Sigma-Aldrich公司，PBDE-47和PBDE-209溶解于DMSO中以制備儲備液。TRIzol試劑、M-MLV反轉錄酶、菌株DH5α、克隆載體pMDl9-T、連接酶、PCR產物回收純化試劑盒和RACE試劑盒均購自TaKaRa公司，其余常規(guī)藥品均為進口或國產分析純。

背角無齒蚌殼長(6.5±0.5) cm，PBDE-47和PBDE-209染毒之前，動物置于實驗室自動水循環(huán)系統(tǒng)中適應養(yǎng)殖2周，期間停止進食。隨后，動物處理實驗在長方形的塑料盒(40 cm×25 cm；10 cm高)中進行，每個盒子里面8只河蚌，飼養(yǎng)采用人工模擬池塘水(每1 L去離子水中含48 mg NaHCO3、33 mg CaCl2·2H2O、60 mg MgSO4·7H2O和0.5 mg KCl)，喂食小球藻(Chlorellavulgaris)。為了確定AwSOD基因的組織分布，對來自同一塑料盒內5只動物進行解剖，取斧足、鰓、肝胰臟、閉殼肌、心臟、血淋巴和外套膜等組織。參考PBDE-47和PBDE-209對淡水生物水蚤毒性效應研究結果[14]，動物處理實驗過程中，動物分為對照組、PBDE-47處理組(6.25、12.5、25、50和100 μg·L-1)和PBDE-209處理組(10、20、40、80和160 μg·L-1)，對照組用同體積DMSO處理，水中DMSO濃度不超過3‰[12]。分別在0、6、12、24和48 h每組中取出5只河蚌，解剖肝胰臟、鰓和血淋巴，液氮速凍，于-80 °C保存。

1.2 總RNA提取與cDNA模板制備

按照試劑盒說明書的要求，使用TRIzol法(Takara，大連)提取總RNA。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。用M-MLV第一鏈cDNA合成試劑盒(Takara，大連)合成第一鏈cDNA，作為PCR擴增反應的模板。

1.3 AwSOD全基因序列的克隆

根據(jù)雙殼綱、腹足綱、昆蟲綱、甲殼綱和脊椎動物在內其他物種的Cu/ZnSOD保守區(qū)域設計簡并引物SOD1和SOD2，用于擴增AwSODcDNA片段，將PCR產物克隆到pMDT-19(Takara，大連)、采用雙向測序，鑒定為Cu/ZnSOD部分序列。以部分cDNA序列中設計特異引物(表1)，根據(jù)RACE試劑盒說明書，采用巢式PCR方法擴增AwSODcDNA的5’和3’區(qū)域。擴增產物克隆載體、雙向測序、序列比對和拼接。

1.4 序列與系統(tǒng)發(fā)育的分析

在GenBank數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中用BLAST方法對AwSOD序列進行了比對和分析；采用DANMEN軟件對AwSOD基因進行多序列比對；采用信號肽預測數(shù)據(jù)庫(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)對AwSOD信號肽序列進行預測；采用SMART數(shù)據(jù)庫(http://smart.embl-heidelberg.de/)對AwSOD蛋白質二級結構域進行預測；采用SWISS模型(http://swissmodel.expasy.org/)對AwSOD的三維結構進行預測；用MEGA 5.0鄰位連接方法，構建AwSOD系統(tǒng)進化樹。

1.5 real-time PCR定量檢測 AwSOD的表達

為了確定AwSOD轉錄水平，采用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒并按照說明書的要求進行定量分析。根據(jù)已有貝類內參基因研究結果[15-16]，選取β-actin作為內參基因，根據(jù)內參基因和AwSOD特異引物分別分離對應序列(表1)，瓊脂糖凝膠電泳僅檢測出一個擴增條帶，PCR產物回收、測序和鑒別；結合溶解曲線和擴增曲線結果確定內參基因和目的基因表達的特異性和高效性。使用ABI7500實時檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國)，采用兩步法，進行real-time PCR，構建標準曲線，通過2-△△CT分析AwSOD表達水平。

表1 本研究中使用的引物的描述Table 1 Description of the primes used in this study

1.6 統(tǒng)計學處理

PBDE-47和PBDE-209處理后AwSOD的表達水平的顯著性差異采用單向方差分析(analysis of variance, ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果(Results)

2.1 背角無齒蚌 AwSOD分子結構

背角無齒蚌AwSODcDNA全長由949個核苷酸組成(GenBank No., KU363382)，包含一個83 bp的5’非翻譯區(qū)(UTR)、401 bp的3’UTR。開放閱讀框由465 bp核苷酸組成，編碼155個氨基酸的多肽鏈，分子量為15.78 kDa，理論等電點為30.22(圖1)。終止信號(AATAAA)位于3’UTR的891～896處。AwSOD與其他的細胞質Cu/ZnSOD序列比對表明，AwSOD包含Cys-7、Cys-57和Cys-146這3個半胱氨酸，其中Cys-57和Cys-146在所有Cu/ZnSOD中都是保守的，證實與分子內二硫鍵的形成有關(圖2)。在AwSOD中，銅結合保守氨基酸殘基分別為His-46、His-48、His-64和His-120，鋅結合保守氨基酸殘基分別為His-64、His-72和His-81及Asp-8。AwSOD氨基酸序列中存在2個高度保守Cu/ZnSOD標簽序列，分別為GKHGFHVHEFGDNT和GNAGARSACGVI(圖2)。

圖1 背角無齒蚌 AwSOD基因的cDNA序列和推導的氨基酸序列注：粗體標示起始(ATG)和終止(TAA)密碼；波浪線標示終止信號“AATAAA”；下劃線標示 AwSOD標簽序列；灰色陰影標示Cu和Zn結合保守位點；方框標示半胱氨酸殘基(Cys-57 and Cys-146)。Fig. 1 The cDNA nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of AwSOD gene of Anodonta woodianaNote: The start codon (ATG) and stop codon (TAA) are indicated in bold; putative polyadenylation signal “AATAAA” is showed with wavy line; the signal sequences of AwSOD are underlined; the binding residues of Cu and Zn are marked with shadow; two cysteines (Cys-57 and Cys-146) formed a disulphide bond are marked with boxs.

圖2 背角無齒蚌AwSOD與其他物種SOD序列多重比對注：紅色邊框標示CuZnSOD標簽序列；陰影標示Cu(His-46, His-48, His-64和His-120)和Zn(His-64, His-72, His-81和Asp-84)結合保守位點；下劃線標示半胱氨酸殘基(Cys-57和Cys-146)。Fig. 2 Multiple alignment of AwSOD of Anodonta woodiana with other species SODsNote: Two signature motifs sequences of CuZnSOD are marked as red box; the amino acids required for Cu (His-46, His-48, His-64, and His-120) and Zn (His-64, His-72 and His-81 and Asp-84) binding are shaded; two cysteines (Cys-57 and Cys-146) formed a disulphide bond are showed with double lines.

AwSOD二級結構和三級結構與Cu/ZnSOD具有較高的相似性，二級結構包含9個β-折疊和2個α-螺旋，其中有Cys-57和Cys-146形成二硫鍵(圖3)。

圖3 背角無齒蚌AwSOD二級和三級結構預測注：(a) AwSOD二級結構；(b) AwSOD的三級結構。Fig. 3 Predicted secondary and tertiary structures of AwSOD deduced amino acids of Anodonta woodianaNote: (a) the secondary structure of AwSOD; (b) the tertiary structure of AwSOD.

2.2 AwSOD系統(tǒng)發(fā)育分析

BLAST分析表明，AwSOD氨基酸序列與Cu/ZnSOD具有較高的同源性，與褶紋冠蚌的同源性為97.42%，與海兔的同源性為61.39%，與斑馬魚的同源性為64.10%，與人的同源性為62.18%。為了研究AwSOD與其他物種Cu/ZnSOD之間親緣關系，采用MEGA 5.0近鄰連接法構建系統(tǒng)進化樹，分別從不同脊椎動物和無脊椎動物中選出了多個Cu/ZnSOD序列，其中包括人、家鼠、非洲爪蟾、斑馬魚、凡納濱對蝦、果蠅、光滑雙臍螺和牡蠣等。AwSOD與淡水貝類親緣關系最近，其次海洋雙殼類，最后是脊椎動物、腹足類和甲殼類(圖4)。

圖4 根據(jù)背角無齒蚌AwSOD氨基酸序列使用鄰接法構建的系統(tǒng)進化樹Fig. 4 Phylogenetic relationship of AwSOD amino acid sequence between Anodonta woodiana and other organisms according to neighbor-joining method

2.3 AwSOD的組織分布

Real-time PCR結果顯示，背角無齒蚌AwSOD在斧足、鰓、肝胰臟、閉殼肌、外套膜和心臟殼中廣泛表達(圖5)。AwSOD在肝胰臟中的mRNA表達水平較高，在鰓和斧足為中等水平，在外套膜、閉殼肌和心臟中表達水平較低(圖5)。

圖5 背角無齒蚌不同組織中 AwSOD基因的表達(n=5)Fig. 5 Real-time PCR analysis of AwSOD transcript from different tissues of Anodonta woodiana (n=5)

2.4 PBDE-47和PBDE-209對肝胰腺 AwSOD表達的影響

在濃度6.25、12.5、25、50和100 μg·L-1的PBDE-47處理組中，肝胰腺中AwSODmRNA水平顯著增加，這種上調效應在濃度6.25、12.5和25 μg·L-1PBDE-47處理組呈現(xiàn)時間和劑量依賴模式；與對照組相比，整個實驗過程中，AwSODmRNA水平在6.25、12.5和25 μg·L-1PBDE-47處理組中分別增加了70.58%(P<0.05)、2.10倍(P<0.01)和2.61倍(P<0.01)以上(圖6)。12.5 μg·L-1和25 μg·L-1的PBDE-47處理組中AwSODmRNA水平分別增加了3.57倍(P<0.01)和2.56倍(P<0.01)(圖6)。

圖6 PBDE-47對背角無齒蚌肝胰腺 AwSOD基因表達的影響注：每處理組的每個時間點n=5；*、**表示與相應對照組相比有顯著差異( P<0.05、 P<0.01)；下同。Fig. 6 Temporal expression of AwSOD in the hepatopancreas of Anodonta woodiana after PBDE-47 challenge as measured by quantitative real-time PCRNote: Data are expressed as means±SE; n=5 in each group at each time point; *, **represent P<0.05, P<0.01, compared with control group at the same time.

與對照組相比，PBDE-209處理后肝胰腺中AwSODmRNA水平隨時間和劑量呈現(xiàn)增加趨勢。在10、20、40、80和160 μg·L-1的處理組中，AwSOD表達水平分別增加了1.03%、77.08%(P<0.05)、91.66% (P<0.05)、1.33倍(P<0.05)和2.60倍(P<0.01) (圖7)。

圖7 PBDE-209對背角無齒蚌肝胰腺 AwSOD基因表達的影響Fig. 7 Temporal expression of AwSOD in the hepatopancreas of Anodonta woodiana after PBDE-209 challenge as measured by quantitative real-time PCR

2.5 PBDE-47和PBDE-209對鰓 AwSOD表達的影響

在濃度6.25 μg·L-1和12.5 μg·L-1的PBDE-47處理組中，鰓中AwSODmRNA水平顯著增加；與對照組相比，整個實驗過程中AwSODmRNA水平在6.25 μg·L-1和12.5 μg·L-1的PBDE-47處理組中分別增加了1.23倍(P<0.05)和1.64倍(P<0.05)以上(圖8)。25 μg·L-1的PBDE-47處理組中，鰓中AwSODmRNA水平在24 h和48 h降至正常水平。25、50和100 μg·L-1的PBDE-47處理組中，鰓中AwSODmRNA水平在24 h和48 h低于正常水平，分別減少了46.96%和72.61%(P<0.05) (圖8)。

圖8 PBDE-47對背角無齒蚌鰓 AwSOD基因表達的影響Fig. 8 Temporal expression of AwSOD in the gill of Anodonta woodiana after PBDE-47 challenge as measured by quantitative real-time PCR

與對照組相比，PBDE-209處理組鰓中AwSODmRNA水平顯著增加。在10、20、40、80和160 μg·L-1的處理組中，AwSOD表達水平分別增加了68.68%(P<0.05)、86.87%(P<0.05)、1.28倍(P<0.05)、1.54倍(P<0.01)和1.75倍(P<0.01)(圖9)。

圖9 PBDE-209對背角無齒蚌鰓 AwSOD基因表達的影響Fig. 9 Temporal expression of AwSOD in the gill of Anodonta woodiana after PBDE-209 challenge as measured by quantitative real-time PCR

3 討論(Discussion)

本研究結果顯示，AwSOD中未發(fā)現(xiàn)信號肽序列，提示AwSOD屬于胞質Cu/ZnSOD家族成員，已經(jīng)過加工并具備了成熟模式。AwSOD氨基酸序列與其他Cu/ZnSODs序列多重比對表明，2個半胱氨酸殘基Cys-57和Cys-146與CuZnSODs氨基酸殘基具有高度保守性，可能與二級結構中二硫鍵的形成有關[17-18]。在AwSOD和其他Cu/ZnSODs序列中，Cu和Zn結合氨基酸殘基相對比較保守，這些保守的氨基酸有助于AwSOD結構穩(wěn)定性和催化的作用[19]。同時，在相對惡劣環(huán)境條件下，這些氨基酸殘基對穩(wěn)定Cu/ZnSODs構象具有潛在作用，有助于Cu和Zn穩(wěn)定Cu/ZnSOD三級結構[20]。

AwSOD在不同組織中呈現(xiàn)不同的表達模式，其中，在肝胰腺組織中AwSODmRNA的表達水平最高，這與肝胰臟作為主要代謝組織和主要防御器官有關。相同的現(xiàn)象在南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)和擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)中也被發(fā)現(xiàn)[21-22]。相當于哺乳動物的肝臟和昆蟲的脂肪體而言，水生無脊椎動物肝胰腺具有肝臟和胰腺雙重功能，不僅是重要的消化器官，而且在非特異性免疫中發(fā)揮著重要的作用[21-22]。肝胰腺具有較高的代謝活性，水體中污染物進入機體后通過代謝過程會產生大量的ROS。AwSOD基因高表達提示其可作為一種重要的肝臟解毒酶。其他組織中AwSOD的廣泛分布有助于將氧自由基快速轉化為普通分子氧(O2)和過氧化氫(H2O2)。

研究發(fā)現(xiàn)，PBDE-47和PBDE-209處理后背角無齒蚌肝胰腺和鰓AwSOD表達水平顯著升高，提示這可能與增強機體ROS清除能力和提高脅迫耐受性有關。伴隨PBDE-47和PBDE-209在機體中的不斷累積，細胞中ROS生成增加，誘發(fā)細胞氧化應激，線粒體出現(xiàn)呼吸爆發(fā)，細胞出現(xiàn)功能性受損。在脅迫條件下，生物本身SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽S轉移酶和硫過氧化物酶表達水平提升，以提高機體清除ROS能力，維持機體穩(wěn)態(tài)。長時間Cd暴露后，非洲爪蟾(Xenopuslaevis)和青鳉(Oryziasjavanicus)Cu/ZnSODmRNA表達水平顯著上調[23]。白斑桿狀病毒染毒后，日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)鰓和血淋巴中Cu/ZnSOD表達水平顯著升高[24]。乳球菌處理后，羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)血淋巴中Cu/ZnSOD表達水平顯著增加[25]。馬拉硫磷、硫丹和二者混合物處理后，南美白對蝦(L.vannamei)血淋巴中Cu/ZnSOD表達水平顯著增加[26]。Cd2+脅迫后，褶紋冠蚌(Cristariaplicata)Cu/ZnSOD基因mRNA水平和酶活性迅速升高，并在72 h和48 h達到峰值，提示Cu/ZnSOD是用于監(jiān)測早期水體重金屬污染的重要靶分子[27]。由此可見，Cu/ZnSOD在維持機體氧自由基代謝平衡、免受氧化損傷、ROS清除和機體保護性防御中起著重要作用。PBDE-47和PBDE-209處理后背角無齒蚌肝胰腺和鰓AwSOD表達水平顯著升高與增強機體抗氧化能力和耐受性有關。

與對照組相比，不同濃度PBDE-47暴露后，肝胰腺中AwSOD在高劑量組出現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象，而在鰓中，AwSOD表達水平在6 h顯著上調，后期出現(xiàn)下調現(xiàn)象，提示這種表達模式與PBDE-47毒性效應和劑量效應有關。正常情況下，動物體內ROS保持相對較低的水平，ROS生成后將迅速被一系列抗氧化酶迅速清除，以維持ROS水平與抗氧化酶活性之間的平衡[28-29]。抗氧化酶是機體內穩(wěn)態(tài)的重要標志之一。鰓作為貝類重要免疫器官，鰓絲直接接觸PBDE-47和PBDE-209，并通過鰓絲呼吸作用迅速進入機體，產生大量ROS，相對于肝胰腺而言，PBDE-47對鰓氧化應激效應更為直接和明顯。持續(xù)高劑量長時間的PBDE-47暴露，導致進入體內PBDE-47超過鰓的解毒極限，則鰓會受到損傷，大量鰓組織中細胞凋亡，處理后期出現(xiàn)表達水平下調現(xiàn)象[30]。相同現(xiàn)象在褶紋冠蚌中也被發(fā)現(xiàn)，Pb2+脅迫后，褶紋冠蚌Cu/ZnSODmRNA的表達先升高后降低，在48 h達到最大值[27]。在PBDE-209處理組中，AwSOD的表達呈時間和劑量依賴性，與所選擇的濃度未達到臨界值，動物在這種濃度可以產生足夠的抗氧化能力，從而保持機體PBDE-209氧化和抗氧化酶還原作用之間的平衡；實驗中選定濃度未檢測到PBDE-209半數(shù)致死濃度進一步證實了這一現(xiàn)象。

研究顯示，地表水中PBDE-47含量為0.25 ng·L-1，PBDE-209含量為1.0 ng·L-1[31]。軟體動物調查結果顯示，PBDE-47、PBDE-99、PBDE-154和PBDE-153含量為0.39～3.65 ng·g-1，PBDE-209作為主要持久性有機污染物含量為10.2～284 ng·g-1[32]。PBDE-47和PBDE-209對淡水資源的負面效應和水生生物的累積效應已成為不可忽視的問題。PBDE-47和PBDE-209對背角無齒蚌機體氧化應激作用是一個綜合的效應，其產生氧化應激后抗氧化系統(tǒng)啟動，涉及多種抗氧化酶的參與。從AwSOD組織特異性表達及PBDE-47和PBDE-209對其表達的誘導作用，背角無齒蚌是用于淡水污染監(jiān)測的重要生物之一。