撲草凈、辛硫磷和亞甲基藍制劑對凡納濱對蝦的急性毒性及組織病理改變

周桂嫻，馬榮榮，楊宗英，胡鯤,*

1. 上海海洋大學，國家水生動物病原庫，上海 201306 2. 上海海洋大學，水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306 3. 農業部淡水水產種質資源重點實驗室，上海 201306 4. 寧波大學，寧波 315000 5. 南昌市農業科學院，南昌 330038

撲草凈是一種常見的三氯苯類除草劑，穩定性很強，易溶于有機溶劑，可用來去除闊葉草[1]。撲草凈的半衰期較長，土壤中為12～18個月，地下水中達88 d，光照條件下河水中是263 d[2]。山東萊州灣近海水域中撲草凈的殘留濃度達到21.2 mg·L-1[3]。李如茵等[4]研究發現，近年來因具有清除水體中絲狀藻類和水草的功能，撲草凈也被頻繁用于水產養殖中，導致水產品中的撲草凈殘留嚴重，極大影響了消費者的健康。

辛硫磷是一種常見的有機磷類殺蟲劑，因具有高效、低毒等優點被用于農作物蟲害防治。辛硫磷被膽堿酯酶代謝后抑制膽堿酯酶的活性，導致乙酰膽堿在突觸內聚集，引起生物神經功能紊亂，從而引發中毒癥狀[5]。近些年來，辛硫磷不僅用于稻蝦立體種養模式中農作物防蟲，而且用于水產養殖中防治魚類寄生蟲病害[6]以及魚類敗血癥[5]。辛硫磷對不同水產動物的安全濃度差異比較大，對虹鱒幼魚的96 h安全濃度是0.407 μg·L-1，屬于劇毒藥物[7]。用辛硫磷殺蟲風險高[8]，因為它能夠極大地影響羅非魚的成活率。實驗結果顯示，辛硫磷對斑馬魚是一種高毒藥物[5]。辛硫磷對凡納濱對蝦養殖的安全性沒有相關的研究報道。

亞甲基藍又名次甲基藍，是一種噻嗪類的染料，近些年來作為孔雀石綠的替代品在水產養殖中經常使用，可以有效控制和治愈魚類的疾病(如爛鰓病和爛皮病等)[9]。亞甲基藍是潛在的高風險化合物，美國和日本等都不允許使用，盡管亞甲基藍的毒性與孔雀石綠相比并不強，但仍然有可能對人類健康帶來影響[10]。

凡納濱對蝦是我國普遍養殖的優良對蝦品種之一，具有廣鹽度養殖、產量較高、養殖周期較短和肉質鮮美等優點。近年來隨著對蝦病害頻繁發生、養殖水域環境的惡化、稻蝦養殖模式的興起，一些化學品如撲草凈、辛硫磷和亞甲基藍等在凡納濱對蝦養殖中被使用并后續在環境中被檢出。雖然，這些化學品屬于殺蟲劑、消毒劑和除草劑，在水產養殖過程中也會被使用。在凡納濱對蝦養殖過程中，撲草凈可以有效去除青苔及水草對養殖水體的影響，辛硫磷被用來防治對蝦寄生蟲，亞甲基藍被用來治療凡納濱對蝦的纖毛蟲和黑鰓病，但撲草凈、辛硫磷和亞甲基藍對凡納濱對蝦的安全性方面卻沒有相關的研究報道。

本文以凡納濱對蝦幼蝦為實驗材料，得到了撲草凈、辛硫磷和亞甲基藍對凡納濱對蝦的48 h半數致死濃度(48 h-LC50)及安全濃度，并分析了隨著時間延長3種藥物對凡納濱對蝦的肝胰腺、腸道組織的影響，旨在探究3種藥物對凡納濱對蝦的急性毒性，為3種藥物在凡納濱對蝦養殖中合理使用和安全性評估提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

1.1.1 受試動物

實驗所用凡納濱對蝦由上海農滄水產養殖公司提供，選擇無病、規格均勻且活力較好的幼蝦進行本次實驗。平均體長(6.0±1) cm，平均體重(3.0+1) g，暫養后選取400尾進行實驗。

1.1.2 實驗方法

實驗在室內進行，使用的水是由充分曝氣無余氯殘留的自來水和過濾消毒后的近海海水混合組成。將幼蝦放入500 L塑料桶中暫養，用充氣泵24 h連續打氧。將養殖水體水溫穩定在(25±1) ℃，pH 8.5±0.5，溶解氧濃度>6.0 mg·L-1，鹽度3‰。每日3次按照對蝦總體重5%投喂配合飼料，暫養7 d。為防止水質污染，每日定時吸取桶底殘餌糞便并換水10%，馴養期間死亡率不超過5%。實驗前1 d停止投喂，對幼蝦進行撲草凈等3種化學品的急性毒性實驗。急性毒性實驗開始時，使用容積為20 L的塑料桶，實驗水體為10 L，桶內放入連接打氧泵的氣泡頭以保證溶氧。為防止受試動物從桶中跳出，使用40目軟尼龍網覆蓋在桶面。在試驗期間，每隔24 h換試驗液一次。在用10% 48 h-LC50藥物濃度處理對蝦后，分別在0、2、4和6 d分離對蝦肝胰腺及腸道做組織切片時，實驗養殖容器為50 L的塑料桶，每桶50尾對蝦。

1.1.3 供試試劑

撲草凈：浙江中山化工集團股份有限公司生產，有效成分含量為40%的可濕性粉劑，產品標準號為GB23553—2009。辛硫磷：山東埃森化學有限公司生產，有效成分含量為40%的乳油制劑，產品標準號為GB9557—2008。亞甲基藍：天津市北聯精細化學品開發有限公司生產，有效成分含量為98.5%的標準品。飽和苦味酸：西隴化工股份有限公司，有效成分含量為99.8%。甲醛溶液：西隴化工股份有限公司，分析純。乙酸：國藥集團化學試劑有限公司，分析純。

撲草凈和辛硫磷采用了符合國標的農藥商品制劑，撲草凈商品制劑中60%其余成分主要是分散劑SD-8113、乙二醇、黃原膠和硅酸鋁鎂等助劑；辛硫磷商品制劑中60%的其他成分主要包含寧乳、乙二醇、黃原膠、有機硅消泡劑和水等，查閱相關文獻，鮮有對凡納濱對蝦的毒性研究[11-12]。

1.1.4 儀器設備

NIKON Eclipse ci顯微鏡，NIKON digital sight DS-FI2成像系統，日本NIKON公司。

1.2 LC50的測定

正式實驗之前先進行預實驗，實驗方法參考《水生生物毒性試驗方法》[13]，根據預實驗的結果確定正式實驗的藥物濃度。正式實驗藥物濃度的確定依據預實驗結果用對數等間距法在濃度范圍中設置5～6個濃度梯度和自然狀態下的空白對照組[14]。實驗采用靜水法，每種藥物組設置1個空白對照組，每個實驗濃度同時設置3個平行，每組10尾蝦。實驗期間定時觀察蝦體的存活狀態、活力狀態以及是否有中毒癥狀，及時撈出死亡的幼蝦，統計并記錄24 h和48 h的幼蝦存活情況。將得到的實驗數據用Excel 2016進行處理，得到藥物濃度-死亡率的線性回歸方程，來計算凡納濱對蝦幼蝦暴露在藥物中24 h和48 h的半致死濃度(24 h-LC50和48 h-LC50)以及相應的95%置信區間[15]。最后采用特倫堡(Turubell)公式計算實驗藥品的安全濃度(SC)[16]，SC=48 h-LC50×0.3/(24 h-LC50/48 h-LC50)2。

1.3 組織切片的制作

在急性毒性實驗結束后，找出各藥物48 h-LC50，用10% 48 h-LC50藥物濃度處理凡納濱對蝦并同時設置空白對照組。在0、2、4和6 d分離對蝦肝胰腺和腸道，放入Bouin’s溶液固定24 h，隨后放入濃度為75%的乙醇中保存。通過剖取組織，常規取材，脫水，包埋，制片，蘇木精-伊紅(HE)染色后，在光學顯微鏡下觀察并描述，并拍攝對應主要描述中不同種類的病變部位。

2 結果(Results)

2.1 凡納濱對蝦的急性毒性

2.1.1 3種藥物對凡納濱對蝦的急性毒性

撲草凈、辛硫磷和亞甲基藍對凡納濱對蝦的急性毒性結果如表1所示。實驗期間，所有空白對照組均未發現死亡情況。凡納濱對蝦給藥前期中毒癥狀主要是出現狂游、狂跳、不斷碰撞箱壁的行為，隨著中毒時間的增長對蝦漸漸安靜、運動能力減弱、出現側臥或者直接死亡。觀察死亡后的對蝦狀態，可以看出凡納濱對蝦在受到撲草凈和亞甲基藍的毒害死亡之后，蝦體呈乳白色，頭部發黑；辛硫磷中毒死亡的對蝦，身體明顯發紅。凡納濱對蝦的死亡率與藥物濃度和暴露時間呈正相關。相同藥物濃度，暴露時間越長，凡納濱對蝦的死亡數量越高；在同一時間內，藥物濃度越高則凡納濱對蝦死亡率也隨著上升。隨著實驗時間的延長，低濃度藥物組中的幼蝦基本與空白對照組的幼蝦狀態一致，高濃度藥物組中的幼蝦在實驗期間(48 h)，3種供試藥物的毒性隨著藥物濃度增大和實驗時間延長呈現增強的趨勢，有顯著的劑量和時間效應。其中，撲草凈、辛硫磷的研究結果只針對其商品化的制劑，不排除有聯合毒性作用產生的可能。

表1 3種藥物對凡納濱對蝦的急性毒性實驗結果Table 1 The acute toxicity test results of three kinds of chemicals to Penaeus vannamei

2.1.2 3種藥物對凡納濱對蝦的半致死濃度、安全濃度和回歸方程

根據表1中急性毒性的實驗結果，經過excel處理之后可以得到表2中回歸方程、相關系數(r2)、半致死濃度(LC50)和安全濃度(SC)。撲草凈對凡納濱對蝦的24 h-LC50和48 h-LC50為13.517 mg·L-1和5.050 mg·L-1，安全濃度為0.211 mg·L-1；辛硫磷對凡納濱對蝦的24 h-LC50和48 h-LC50為6.32 μg·L-1和1.03 μg·L-1，安全濃度為0.0083 μg·L-1；亞甲基藍對凡納濱對蝦的24 h-LC50和48 h-LC50為5.769 mg·L-1和4.698 mg·L-1，安全濃度為0.935 mg·L-1。由表2可知，這3種藥物對凡納濱對蝦的毒性為辛硫磷>亞甲基藍>撲草凈。

表2 3種藥物對凡納濱對蝦的半致死濃度(LC50)和安全濃度(SC)Table 2 The values of median lethal concentration (LC50) and safe concentration (SC) of three kinds of chemicals to Penaeus vannamei

2.2 3種藥物對蝦組織病理學的影響

2.2.1 撲草凈對凡納濱對蝦的組織病理學影響

2.2.1.1 肝胰腺組織病理變化

撲草凈脅迫凡納濱對蝦0 d的肝胰腺組織結構如圖1(a)所示，肝胰臟中肝管排列緊密，肝管壁由單層柱狀細胞組成，主要為分泌細胞和吸收細胞，分泌細胞內可見大小不等的液泡，小管間隙有少量結締組織及毛細血管，組織未見明顯異常。撲草凈處理0 d組(圖1(a))和2 d組(圖1(b))肝胰臟中肝管排列緊密，肝管壁由單層柱狀細胞組成，主要為分泌細胞和吸收細胞，分泌細胞內可見大小不等的液泡，肝小管間隙有少量結締組織及毛細血管。撲草凈處理4 d組(圖1(c))，肝小管排列緊密，但可以看到管壁細胞壞死，胞核固縮深染，少量小管結構破壞，管壁細胞缺失。撲草凈處理6 d組(圖1(d))，局部肝管排列疏松，間質增寬，間質內可見較多鄰近組織脫落的細胞，可見部分炎性細胞浸潤。

圖1 撲草凈脅迫對凡納濱對蝦的肝胰腺組織形態的影響注：(a)撲草凈處理0 d組；(b)撲草凈處理2 d組；(c)撲草凈處理4 d組，管壁細胞壞死()或缺失()；(d)撲草凈處理6 d組，間質內可見較多鄰近組織脫落的細胞()偶見炎性細胞浸潤()。Fig. 1 Effect of prometryn stress on hepatopancreas morphology of Penaeus vannameiNote: (a) 0 d group of prometryn treatment; (b) 2 d group of prometryn treatment; (c) 4 d group of prometryn treatment, and the wall cells were necrotic () or absent (); (d) 6 d group of prometryn treatment, and more cells from adjacent tissues were observed in the interstitium () and occasionally inflammatory cell infiltration was observed ().

2.2.1.2 腸道組織病理變化

圖2(a)所示，組織中黏膜層上皮細胞排列緊密，呈柱狀，形態正常，上皮細胞內側可見幾丁質層，上皮外側可見結締組織層及肌層，組織整體未見明顯異常。撲草凈處理2 d組(圖2(b))腸道組織的黏膜層上皮完整，上皮細胞排列緊密，腸腔內可見少量脫落的上皮樣細胞，與0 d相比基本無異常；撲草凈處理4 d組(圖2(c))，黏膜層局部上皮缺失，腸腔內明顯可見大量脫落的上皮細胞，較多上皮細胞腫脹，胞質疏松淡染；撲草凈處理6 d組(圖2(d))，黏膜層大量上皮細胞脫落入管腔，較多上皮細胞腫脹，胞質呈空泡狀。

圖2 撲草凈脅迫對凡納濱對蝦的腸道組織形態的影響注：(a)撲草凈處理0 d組；(b)撲草凈處理2 d組，少量上皮細胞脫落()；(c)撲草凈處理4 d組，上皮缺失()，腸腔內有脫落的上皮細胞()，上皮細胞胞質疏松()；(d)撲草凈處理6 d組，上皮細胞大量脫落入管腔()，胞質呈空泡狀()。Fig. 2 Effect of prometryn stress on gut morphology of Penaeus vannameiNote: (a) 0 d group of prometryn treatment; (b) 2 d group of prometryn treatment, a small number of epithelial cells were shed (); (c) 4 d group of prometryn treatment, epithelial deletion (), detached epithelial cells () in the lumen, and loose cytoplasm of epithelial cells (); (d) 6 d group of prometryn treatment, epithelial cells were shed into lumen (), and cytoplasm was vacuolized ().

2.2.2 辛硫磷對凡納濱對蝦的組織病理學變化

2.2.2.1 肝胰腺組織病理變化

辛硫磷脅迫凡納濱對蝦0 d的肝胰腺組織結構如圖3(a)所示，肝胰腺中肝管排列緊密，肝管壁由單層柱狀細胞組成，主要為分泌細胞和吸收細胞，分泌細胞內可見大小不等的液泡，小管間隙有少量結締組織及毛細血管，組織未見明顯異常。與辛硫磷處理0 d相比，2 d組(圖3(b))肝管排列緊密，少量管壁細胞脫離基底膜，并可見管壁斷裂，管壁細胞脫落。辛硫磷處理4 d組(圖3(c))，肝管排列緊密，少量管壁細胞脫落入管腔，較多管壁上皮細胞脫離基底膜，部分管壁細胞腫脹，胞質疏松淡染。辛硫磷處理6 d組(圖3(d))，局部肝管排列疏松，間質增寬，少量管壁上皮細胞脫離基底膜，少量管壁不完整，細胞缺失，少量管壁細胞脫落入管腔。

2.2.2.2 腸道組織病理變化

如圖4(a)所示，組織中黏膜層上皮細胞排列緊密，呈柱狀，形態正常，上皮細胞內側可見幾丁質層，上皮外側可見結締組織層及肌層，組織整體未見明顯異常。與辛硫磷處理0 d相比，2 d組(圖4(b))組織黏膜層少量上皮細胞脫落，上皮細胞腫脹，胞質呈空泡狀；辛硫磷處理4 d組(圖4(c))，組織局部黏膜上皮細胞缺失，腸腔內可見少量脫落的上皮細胞，上皮細胞腫脹，胞質空泡狀。辛硫磷處理6 d組(圖4(d))，腸組織大面積溶解，局部可見上皮細胞脫落。

圖4 辛硫磷脅迫對凡納濱對蝦的腸道組織形態的影響注：(a)辛硫磷處理0 d組；(b)辛硫磷處理2 d組，上皮細胞脫落()胞質呈空泡狀()；(c)辛硫磷處理4 d組，上皮細胞缺失()，腸腔內有脫落的上皮細胞()，胞質空泡狀()；(d)辛硫磷處理6 d組，腸組織大面積溶解()，局部可見上皮細胞脫落()。Fig. 4 Effect of phoxim stress on gut morphology of Penaeus vannameiNote: (a) 0 d group of phoxim treatment group; (b) 2 d group of phoxim treatment group, the epithelial cells were exfoliated () and the cytoplasm was vacuolar (); (c) 4 d group of phoxim treatment group, epithelial cells were absent (), epithelial cells were shed in the lumen (), and cytoplasmic vacuoles () were observed; (d) 6 d group of phoxim treatment group, large area of intestinal tissue was dissolved (), and epithelial cells were shed locally ().

2.2.3 亞甲基藍對凡納濱對蝦的組織病理學變化

2.2.3.1 肝胰腺組織病理變化

亞甲基藍脅迫凡納濱對蝦0 d的肝胰腺組織結構如圖5(a)所示，肝胰腺中肝管排列緊密，肝管壁由單層柱狀細胞組成，主要為分泌細胞和吸收細胞，分泌細胞內可見大小不等的液泡，小管間隙有少量結締組織及毛細血管，組織未見明顯異常。與亞甲基藍處理0 d相比，2 d組(圖5(b))少量肝管上皮變薄，管腔擴大，液泡破裂，偶見管壁斷裂，少量管壁細胞脫落；亞甲基藍處理4 d組(圖5(c))，組織內肝管排列疏松，部分肝管結構破壞，不完整，細胞缺失，并可見管壁細胞脫離基底膜，少量管壁細胞壞死，胞核固縮深染或碎裂溶解；亞甲基藍處理6 d組(圖5(d))，小范圍肝管排列疏松，間隙增寬，少量肝管結構不完整，管壁細胞缺失，并可見細胞脫落。

2.2.3.2 腸道組織病理變化

如圖6(a)所示，組織中黏膜層上皮細胞排列緊密，呈柱狀，形態正常，上皮細胞內側可見幾丁質層，上皮外側可見結締組織層及肌層，組織整體未見明顯異常。與亞甲基藍處理0 d相比，2 d組(圖6(b))腸組織，黏膜層為單層柱狀上皮，上皮向腸腔內突起形成皺襞，黏膜下結締組織中可見較多毛細血管，結締組織外為肌層，腸腔內可見少量脫落的細胞；亞甲基藍處理4 d組(圖6(c))，腸組織大面積溶解，大量上皮細胞消失，腸腔內可見少量脫落的上皮細胞；亞甲基藍處理6 d組(圖6(d))，黏膜層上皮完全喪失，腸腔內可見少量脫落的上皮細胞。

3 討論(Discussion)

3.1 撲草凈對凡納濱對蝦的急性毒性效應

撲草凈對水生環境和生物都有一定的影響，不僅能夠直接對水生生物產生毒性，還可以通過對水體中的藻類、水草類的清除作用間接影響水生動物生長。據有關報道，2019年上旬，為控制青苔爆發，多家漁藥企業推出殺青苔的藥物，殺青苔的同時導致人工種植的水草大面積死亡，養殖蝦蟹大量死亡，這種除青苔的藥物主要成分就是撲草凈[17]。撲草凈對魚類也有很大影響，長期暴露在撲草凈中的鯉魚免疫指標超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽還原酶(GR)的活性有一定變化[18]。撲草凈對虹鱒魚的急性毒性實驗結果顯示，96 h-LC50為2.9 mg·L-1[19]，屬于高毒藥物。在本實驗中得到撲草凈對凡納濱對蝦的安全濃度為0.211 mg·L-1，是高度藥物，需謹慎使用。在研究中，使用了撲草凈的商品化制劑，其他成分沒有相關毒性作用研究結果，不能排除聯合毒性作用的可能。

根據實驗結果，暴露在撲草凈試液中的凡納濱對蝦的肝胰腺組織隨著暴露時間的增長，損傷越來嚴重。在暴露4 d和6 d后肝胰腺出現了少量小管結構破壞、管壁細胞缺失等癥狀。撲草凈對凡納濱對蝦腸道組織也有一定的影響，隨著暴露時間的增長，腸道粘膜層的上皮細胞溶解量增多，胞質呈空泡狀。在水產養殖過程中直接投入撲草凈、稻蝦養殖中用撲草凈清除稻田中的雜草可能導致撲草凈殘留，這都可能對凡納濱對蝦健康產生影響。

3.2 辛硫磷對凡納濱對蝦的急性毒性效應

辛硫磷是目前廣泛使用、高效和低毒的有機磷制劑，盡管有相關研究證明其對水生動物有一定的毒性，但水產養殖中常被用來防治寄生蟲類[20]。辛硫磷對斑馬魚的毒性實驗表明，撲草凈對斑馬魚胚胎、幼魚和成魚的48 h-LC50是45.72(28.79～129.4)、1.27(0.94～1.89)和1.38(0.97～2.91) mg·L-1；96 h-LC50是26.48(18.33～45.53)、0.89(0.61～1.18)和1.01(0.77～1.45) mg·L-1，屬于中高毒藥物[21]。在實驗中，辛硫磷對凡納濱對蝦的24 h-LC50和48 h-LC50為6.32 μg·L-1和1.03 μg·L-1，安全濃度為0.0083 μg·L-1，表明凡納濱對蝦對辛硫磷極為敏感。研究實驗中，使用了辛硫磷乳油商品制劑，所以并不排除其他成分與辛硫磷產生聯合毒性的可能。

觀察經過一定濃度的辛硫磷處理后的凡納濱對蝦肝胰腺組織可知，凡納濱對蝦肝胰腺組織的損傷與辛硫磷濃度和暴露時間有緊密的關聯，在暴露4 d和6 d后的肝胰腺組織有肝管排列疏松，間質增寬，少量管壁上皮細胞脫離基底膜，少量管壁不完整，細胞缺失，少量管壁細胞脫落入管腔等現象；腸道組織也出現了大面積溶解，局部可見上皮細胞脫落等不良現象。辛硫磷對魚蝦都有很強的毒性，且對蝦的毒性要比魚類更強，在水產養殖中應謹慎使用辛硫磷，以免造成不必要的損失。

3.3 亞甲基藍對凡納濱對蝦的毒性效應

亞甲基藍是一種抗菌藥物，和孔雀石綠和結晶紫一樣，可以用于治療魚類的腐皮病等[22]，近年來也被用于治療對蝦纖毛蟲病和黑鰓。但是由于亞甲基藍可能會對人體健康產生危害，所以在美國和日本等國家已經被禁用，在中國還沒有相關的明確規定。亞甲基藍對鳑鲏魚幼魚的安全濃度為0.96 mg·L-1[23]，屬于高毒藥物；亞甲基藍對團頭魴的安全濃度是8.84 mg·L-1[24]。亞甲基藍對凡納濱對蝦溞狀幼體、糠蝦和仔蝦的安全濃度分別為0.025、0.029和0.073 mg·L-1[25]，亞甲基藍對凡納濱對蝦的安全濃度隨著蝦體成長而增大，本實驗得到幼蝦的安全濃度是0.935 mg·L-1。

隨著暴露時間增長，凡納濱對蝦肝胰腺和腸道組織都出現了更嚴重的病變。在暴露4 d和6 d后可以看出肝胰腺組織的部分肝管結構破壞，細胞缺失，少量管壁細胞壞死，胞核固縮深染或碎裂溶解；在暴露6 d后，腸道組織黏膜層上皮完全喪失，腸腔內可見少量脫落的上皮細胞。亞甲基藍對凡納濱對蝦的毒性機制尚未有相關的研究成果，但從組織切片結果來看，對肝胰腺組織和腸道都有一定的損傷，所以在養殖過程中還需謹慎使用。