16種農(nóng)藥制劑對意大利蜜蜂的急性毒性及初級風險評估

張艷峰，王會利

中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境生物技術重點實驗室，北京 100085

農(nóng)藥在控制有害生物危害和保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等方面發(fā)揮了重要作用，但是農(nóng)藥的不合理使用也給生態(tài)環(huán)境和人類健康帶來了很多負面的影響[1-2]。研究表明約80%的化學農(nóng)藥施用后會直接進入環(huán)境，并在大氣、土壤和水等環(huán)境介質之間遷移和擴散，而且有可能生物累積和生物放大，進而對環(huán)境生物造成嚴重危害[3]。

蜜蜂是自然界最主要的傳粉昆蟲，同時為人類提供了豐富的蜂產(chǎn)品[4-5]。蜜蜂在田間采花授粉過程中可通過直接經(jīng)口攝入和體表接觸等途徑暴露于農(nóng)藥中，因此，農(nóng)藥在蜜源作物上使用難免會對蜜蜂造成影響，包括行為變化及個體死亡，甚至可導致整個種群的變化。進入21世紀以來，美洲和歐洲相繼爆發(fā)了大規(guī)模的蜂群崩潰失調癥(Colony Collapse Disorder)，這些都與現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中農(nóng)藥的大量使用密切相關[6-7]。如已被歐盟限制使用的新煙堿類殺蟲劑能夠在極低的劑量下作用于昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)中的煙堿乙酰膽堿受體(nAChRs)，在殺死害蟲的同時，也會危害蜜蜂等非靶標生物[8-9]。與其他昆蟲相比，蜜蜂基因組中缺乏能夠編碼解毒酶的基因，這使得蜜蜂更容易受到農(nóng)藥的危害[10]。國內外均將蜜蜂作為監(jiān)測農(nóng)藥環(huán)境風險的指示昆蟲[11]，保護蜜蜂種群對于保證環(huán)境安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展關系重大。

農(nóng)藥環(huán)境風險評估是在急性毒性試驗的基礎上，關注農(nóng)藥對整個生態(tài)系統(tǒng)直接或間接的影響，是將孤立的環(huán)境行為、環(huán)境生態(tài)和非靶標生物的毒性資料等進行整合，科學評判農(nóng)藥的環(huán)境風險，從而更科學、直觀地反映農(nóng)藥在使用中對環(huán)境影響的實際情況，因此，農(nóng)藥風險評估具有重要的現(xiàn)實意義。本文選擇了16種農(nóng)藥制劑，研究其對意大利蜜蜂的急性經(jīng)口毒性和急性接觸毒性，并進行初級風險評估，旨在為我國農(nóng)藥的安全合理使用提供科學依據(jù)，同時為這些農(nóng)藥品種的再評估工作奠定基礎。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗材料

1.1.1 供試生物

意大利蜜蜂(ApismelliferaL.)，以下簡稱蜜蜂引種自北京長文山水間養(yǎng)殖中心，實驗室自行保種繁育。試驗選用大小一致健康活潑的成年工蜂并在試驗前饑餓2 h。

1.1.2 藥劑

30%蟲螨腈懸浮劑、50%丁醚脲可濕性粉劑、10%高效氯氰菊酯水乳劑、10%高效氯氟氰菊酯懸浮劑、30%噻蟲胺懸浮劑、21%噻蟲嗪懸浮劑、15%高效氯氟氰菊酯·噻蟲嗪懸浮劑(3∶2)、10%高效氯氟氰菊酯·噻蟲胺懸浮劑(1∶3)、30%草甘膦水劑、30%草銨膦水劑、45%莎稗磷乳油、30%氰氟草酯乳油、480 g·L-1滅草松可溶液劑、50%吡唑醚菌酯水分散粒劑、20%氰霜唑懸浮劑、50%氟啶胺懸浮劑和98.3%樂果原藥，均由中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心農(nóng)藥與環(huán)境評價實驗室提供；丙酮(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。

1.1.3 試驗設備

試驗蜂籠(長×寬×高為9.3 cm×9.3 cm×7 cm的木質方框，上下表面用紗網(wǎng)密封，自制)；飼喂器(底部穿孔的200 μL離心管，美國Axygen公司)；微量點滴儀(Hamilton-DIS50μL，瑞士Hamilton公司)；電子天平(AL104-IC，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；CO2麻醉裝置(自制)。

1.2 試驗方法1.2.1 蜜蜂急性經(jīng)口毒性試驗

將供試農(nóng)藥制劑用去離子水配制成母液后用50%(m/m)蔗糖水稀釋成一系列濃度，詳細濃度梯度如表1所示。采用飼喂法對蜜蜂進行染毒，具體操作如下：將蜜蜂麻醉后引入試驗蜂籠，用飼喂器取100 μL不同濃度供試物藥液飼喂蜜蜂；4 h后取出飼喂器，換用不含供試物的50%(m/m)蔗糖水持續(xù)飼喂至試驗結束，測定每組藥液的消耗量。同時設空白對照組，僅飼喂不含供試物的50%(m/m)蔗糖水。處理組和對照組均設3個重復，每個重復10頭蜜蜂。處理后24 h和48 h分別觀察蜜蜂的中毒癥狀與死亡情況。暴露實驗在(25±2) ℃、相對濕度為50%～70%的黑暗人工氣候室內進行。

1.2.2 蜜蜂急性接觸毒性試驗

將供試農(nóng)藥制劑用丙酮配制成母液后用丙酮稀釋成一系列濃度，詳細濃度梯度如表1所示。采用微量點滴法對蜜蜂進行染毒，具體操作如下：將蜜蜂麻醉后取出，用微量點滴儀吸取供試物藥液，于蜜蜂中胸背板處點滴1 μL，待蜂身晾干后，將染毒蜜蜂轉移至試驗蜂籠，用50%蔗糖水(m/m)持續(xù)飼喂至試驗結束。同時設空白對照組和溶劑對照組，空白對照組只引入麻醉的蜜蜂不點滴，溶劑對照組只用丙酮進行點滴，其他同處理組。處理組、空白對照組和溶劑對照組均設3個重復，每個重復10頭蜜蜂。處理后24 h和48 h分別觀察蜜蜂的中毒癥狀與死亡情況。暴露實驗在(25±2) ℃、相對濕度為50%～70%的黑暗人工氣候室內進行。

表1 16種農(nóng)藥制劑田間推薦最高施用量及染毒濃度Table 1 The maximum recommended application rates (AR) and exposure levels of 16 pesticide formulations

1.2.3 樂果參比試驗

參比試驗方法同1.2.1和1.2.2。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)蜜蜂實際暴露量和死亡率，采用SPSS18.0軟件Probit概率統(tǒng)計法計算48 h半致死劑量(48 h-LD50)及95%置信區(qū)間。風險商值(RQ)按照噴施暴露場景下的公式RQ=AR/(LD50×50)進行計算，其中，RQ為噴霧暴露場景的風險商值，AR為農(nóng)藥推薦單次最高施用量(g a.i.·hm-2)(表1)，LD50為半致死劑量(μg a.i.·蜂-1)。

1.4 毒性等級和風險等級劃分

蜜蜂急性經(jīng)口毒性和急性接觸毒性的等級劃分，參照農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則 第10部分：蜜蜂急性毒性試驗》[12]分為4個等級：低毒(LD50>11.0 μg a.i.·蜂-1)；中毒(2.0 μg a.i.·蜂-1

對蜜蜂的初級風險評估采用《農(nóng)藥登記 環(huán)境風險評估指南 第4部分：蜜蜂》[13]中的RQ值進行表征，RQ≤1時，風險可接受；RQ>1時，風險不可接受。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 急性經(jīng)口毒性和初級風險評估

8種殺蟲劑對蜜蜂的急性經(jīng)口毒性均為高毒(表2)。45%莎稗磷乳油的48 h-LD50為5.90 μg a.i.·蜂-1，急性經(jīng)口毒性為中毒。30%草甘膦水劑、30%草銨膦水劑、30%氰氟草酯乳油、480 g·L-1滅草松可溶液劑、50%吡唑醚菌酯水分散粒劑、20%氰霜唑懸浮劑和50%氟啶胺懸浮劑的48 h-LD50均≥100 μg a.i.·蜂-1(表2)，這7種制劑急性經(jīng)口毒性均為低毒。蜜蜂中毒后表現(xiàn)為行動遲緩，失去平衡等癥狀，死亡后蜂喙伸出，翅膀展開。30%蟲螨腈懸浮劑、50%丁醚脲可濕性粉劑、30%噻蟲胺懸浮劑、21%噻蟲嗪懸浮劑、15%高效氯氟氰菊酯·噻蟲嗪懸浮劑、10%高效氯氟氰菊酯·噻蟲胺懸浮劑和45%莎稗磷乳油的RQ值均>1，風險不可接受；其余8種制劑的RQ值均<1，風險可接受(表2)。

表2 16種制劑對蜜蜂的急性經(jīng)口毒性和風險商值(RQ)Table 2 Acute oral toxicity and risk quotient (RQ) of 16 formulations to Apis mellifera

2.2 急性接觸毒性和初級風險評估

8種殺蟲劑中，10%高效氯氟氰菊酯·噻蟲胺懸浮劑的48 h-LD50為0.000234 μg a.i.·蜂-1，對蜜蜂的急性接觸毒性為劇毒；50%丁醚脲可濕性粉劑的48 h-LD50為2.11 μg a.i.·蜂-1，急性接觸毒性為中毒；其余6種制劑的急性接觸毒性均為高毒(表3)。45%莎稗磷乳油的48 h-LD50為5.42 μg a.i.·蜂-1，急性接觸毒性為中毒。30%草甘膦水劑、30%草銨膦水劑、30%氰氟草酯乳油、480 g·L-1滅草松可溶液劑、50%吡唑醚菌酯水分散粒劑、20%氰霜唑懸浮劑和50%氟啶胺懸浮劑的48 h-LD50均≥100 μg a.i.·蜂-1(表3)，這7種制劑的急性接觸毒性均為低毒。蜜蜂中毒后表現(xiàn)為行動遲緩，失去平衡等癥狀，死亡后蜂喙伸出，翅膀展開。30%蟲螨腈懸浮劑、50%丁醚脲可濕性粉劑、10%高效氯氰菊酯水乳劑、10%高效氯氟氰菊酯懸浮劑、30%噻蟲胺懸浮劑、21%噻蟲嗪懸浮劑、15%高效氯氟氰菊酯·噻蟲嗪懸浮劑、10%高效氯氟氰菊酯·噻蟲胺懸浮劑和45%莎稗磷乳油的RQ值均>1，風險不可接受；其余7種制劑的RQ值均<1，風險可接受(表3)。

表3 16種制劑對蜜蜂的急性接觸毒性和風險商值Table 3 Acute contact toxicity and risk quotient of 16 formulations to Apis mellifera

2.3 樂果參比試驗

樂果作為參比物質，對蜜蜂急性經(jīng)口試驗48 h-LD50為0.262 μg a.i.·蜂-1，在0.10～0.35 μg a.i.·蜂-1范圍內；對蜜蜂急性接觸試驗48 h-LD50為0.216 μg a.i.·蜂-1，在0.10～0.30 μg a.i.·蜂-1范圍內；均符合試驗要求[12]，說明試驗體系和試驗方法可靠。

3 討論(Discussion)

本研究選取的農(nóng)藥品種涵蓋了殺蟲劑、除草劑和殺菌劑三大類，它們對蜜蜂的急性毒性和風險差異很大，10%高效氯氟氰菊酯·噻蟲胺懸浮劑急性接觸毒性和風險最高，48 h-LD50和RQ值分別為0.000234 μg a.i.·蜂-1和1 538.46，與目前關注的新煙堿類和菊酯類殺蟲劑對蜜蜂的影響結果一致[14-19]；低毒制劑的48 h-LD50≥100 μg a.i.·蜂-1，最小的RQ值為0.02。總體來看，殺蟲劑對蜜蜂的急性毒性較高且風險高，除草劑和殺菌劑對蜜蜂的急性毒性較低且風險低，這可能與致毒機理和作用方式不同有關[20-22]。上述絕大部分制劑對蜜蜂的風險表現(xiàn)為低毒低風險和高毒高風險的趨勢，說明急性毒性是風險性的內在決定因素。另一方面，在急性毒性數(shù)據(jù)基礎上，引入田間施用量的因素，更能準確直觀地體現(xiàn)農(nóng)藥對蜜蜂的風險，由此可見，嚴格控制田間施用量，合理使用農(nóng)藥是降低農(nóng)藥風險的重要手段。

10%高效氯氟氰菊酯懸浮劑對蜜蜂的急性毒性為高毒(48 h-LD50分別為0.445 μg a.i.·蜂-1和0.530 μg a.i.·蜂-1)，21%噻蟲嗪懸浮劑對蜜蜂的急性毒性為高毒(48 h-LD50分別為0.314 μg a.i.·蜂-1和0.110 μg a.i.·蜂-1)，30%噻蟲胺懸浮劑對蜜蜂的急性毒性為高毒(48 h-LD50分別為0.00589 μg a.i.·蜂-1和0.0106 μg a.i.·蜂-1)；高效氯氟氰菊酯和噻蟲嗪2種有效成分復配后，15%高效氯氟氰菊酯·噻蟲嗪懸浮劑的急性毒性和風險性明顯升高(48 h-LD50分別為0.00882 μg a.i.·蜂-1和0.0299 μg a.i.·蜂-1)；高效氯氟氰菊酯和噻蟲胺2種有效成分復配后，10%高效氯氟氰菊酯·噻蟲胺懸浮劑的接觸急性毒性等級升高為劇毒(48 h-LD50為0.000234 μg a.i.·蜂-1)。這可能與2種有效成分不同的致毒機制疊加有關，不同的復配比例、助劑或劑型也可能影響到急性毒性結果。由此可見，復配制劑對環(huán)境生物的毒性風險存在差異[23-24]，其不同組分釋放到環(huán)境中可能會對環(huán)境生物產(chǎn)生加和作用、協(xié)同作用和拮抗作用等不同的聯(lián)合毒性效應，導致風險評估的不確定性大大增加[25]。

對蜜蜂的環(huán)境風險評估可以明確對蜜蜂存在風險的農(nóng)藥品種，據(jù)此實施相應的風險規(guī)避措施降低對蜜蜂的危害。美國環(huán)境保護局(US EPA)于2014年頒布了農(nóng)藥對蜜蜂的風險評價指南，在農(nóng)藥標簽規(guī)范中強調禁止在蜜蜂活動區(qū)域使用新煙堿類農(nóng)藥，以保護蜜蜂及其他授粉昆蟲。歐洲食品安全局(EFSA)于2013年發(fā)布了新煙堿類殺蟲劑對蜜蜂的風險評估報告，認為該類產(chǎn)品不僅對蜜蜂可產(chǎn)生急性毒害，而且可能對蜜蜂種群帶來嚴重影響，同時限制噻蟲嗪、吡蟲啉和噻蟲胺3種新煙堿類殺蟲劑在夏季糧谷類作物和蜜源作物上使用[26]。針對本文中高風險殺蟲劑，建議采取如下措施減少對蜜蜂的暴露量：錯開作物花期施用甚至考慮晚間施用或施用前及時清除周圍蜜源/粉源植物；根據(jù)實際需求減少田間施用劑量或減少施藥次數(shù)；改用低毒化的農(nóng)藥劑型或風險較低的替代農(nóng)藥；保護或臨時封閉蜂箱；僅限溫室等封閉場所使用。

農(nóng)藥在真實條件下的環(huán)境歸趨和影響各不相同，施藥時間與作物花期之間的關系錯綜復雜，花粉花蜜中的實際殘留量很難獲得，因而使得評估結果相對保守，對環(huán)境生物的風險可能被高估。梁秀美等[27]研究了茶園花期用藥后蜂花粉中吡蟲啉及其代謝物的殘留量，并評估了對蜜蜂的初級風險，結果表明，吡蟲啉在茶樹上的使用對蜜蜂具有不可接受的急性接觸風險。對蜜蜂高風險的農(nóng)藥品種還需要通過半田間或田間試驗，觀察農(nóng)藥對蜜蜂的慢性毒性效應、累積毒性效應以及種群生存和生長發(fā)育的毒性效應，進行高級風險評估。有些農(nóng)藥母體可能是低毒低風險，但其在環(huán)境中的降解產(chǎn)物可能與母體性質迥異，這些降解產(chǎn)物在未來的風險評估中也需要加以關注。本研究一方面為農(nóng)藥的合理使用和管理提供了參考，另一方面提示我們只有通過深入全面的風險評估程序，合理規(guī)范的農(nóng)藥使用，才能減少農(nóng)藥對蜜蜂的危害。