挖掘臨床診斷監測新指標，推動肝病診療進步
——記北京大學人民醫院肝病研究所、病原生物學系魯鳳民教授

本刊記者：東 來

實驗確證血清HBV RNA的來源并探索其潛在臨床意義

乙型肝炎病毒（HBV）感染可引起急、慢性乙型肝炎（CHB）、肝硬化、失代償性肝硬化和肝癌，是嚴重危害人類健康的公共衛生問題。存在于感染肝細胞核內的共價閉合環狀DNA（cccDNA）是病毒復制模板，也是HBV持續復制和建立持久感染的重要根源。核苷（酸）類藥物（NAs）治療可有效阻 斷H B V松弛 環狀DNA（rcDNA）的合成，導致慢性乙肝患者血清中HBV DNA迅速下降至低于檢測下限。然而，此時患者體內的cccDNA可能仍在活躍轉錄。由于有創傷性，臨床上難以普遍開展肝穿刺活組織檢查，以檢測肝組織內cccDNA存在及其活性。探索能夠反映肝組織內cccDNA活性的替代血清學指標具有十分重要的意義。2016年，魯鳳民教授團隊證實血清中的HBV RNA為存在于病毒核衣殼內的未經或部分逆轉錄的前基因組RNA（pgRNA）。患者體內除了HBV DNA病毒顆粒外，還有“HBV RNA病毒樣顆粒”的存在。由于血清HBV RNA來自于感染肝細胞內cccDNA轉錄所產生的pgRNA，且不易受NAs的影響，理論上應能反映病毒復制模板cccDNA的存在和轉錄活性，可作為反映肝組織內cccDNA活性或狀態的替代血清學指標。

目前，各國指南均有鞏固治療后停藥的建議，但由于無法預判停藥復發風險，這些建議往往缺乏可操作性。針對這一問題，魯鳳民教授團隊研究發現，接受NAs鞏固治療的患者如果血清中HBV RNA陽性往往預示著更高的停藥后發生病毒反彈和疾病復發的風險，甚至對于那些經抗病毒治療后發生HBsAg陰轉的慢乙肝患者，如果停藥時血清HBV RNA陽性，仍然有發生病毒反彈的風險。據此，他們提出了血清HBV DNA和HBV RNA均持續消失（低于檢測下限）這一新的完全病毒學應答定義，并以此為基礎修訂了“部分治愈”的定義，提出了“準臨床治愈”的概念。其中，修訂的“部分治愈”指的是慢乙肝患者經抗病毒治療后肝功能恢復正常，血清HBV DNA和HBV RNA持續低于檢測下限，RNA指標的納入將會大大提高原來定義的停藥后持續維持病毒學應答的可能性；而“準臨床治愈” 則是在“部分治愈”的基礎上將血清HBsAg水平低于1500 IU/mL作為重要的參考指標，以在長期接受NAs抗病毒治療的患者中，明確哪些人更易于獲得臨床治愈，并和臨床專家一起提出了以臨床治愈為目標的優化治療路徑的建議。該建議以患者血清HBV RNA陽性與否為參考指標，對“準臨床治愈”的患者采取加用Peg-IFN的聯合治療或換用Peg-IFN的序貫治療，以期使更多的慢乙肝患者能夠實現臨床治愈。通過慢乙肝抗病毒治療階梯式“治愈”的建議，期望有助于推動慢乙肝臨床治愈的精準治療路徑，最終有助于更多的慢乙肝患者實現臨床治愈。

發現NAs治療下產生的HBV病毒顆粒主要為復制缺陷型，并明確了監測復制全能性HBV DNA的潛在臨床意義

NAs是目前應用最廣泛的抗HBV藥物，該類藥物的主要作用機制是與天然核苷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP中的同類物競爭，摻入正在逆轉錄合成的HBV負鏈DNA、或正在合成的子代病毒正鏈DNA中，從而使新鏈延伸被提前終止，抑制病毒基因組DNA的復制。理論上講，NAs的摻入將導致新合成HBV DNA鏈的不可逆終止，使“子代病毒”失去感染性。為證明這一點，魯鳳民教授團隊實驗驗證NAs的摻入的確可導致子代病毒顆粒內新合成病毒DNA鏈的不可逆終止，導致HBV“子代病毒”難以建立感染。該研究為抗病毒治療阻斷母嬰垂直傳播和肝移植病人的水平傳播補充了理論依據，為NAs治療慢乙肝的應答機制提供了更為全面的解釋。

我國存在一定比例的HBV隱匿性感染者（OBI）。OBI仍可使疾病慢性進展，導致肝硬化甚至肝細胞癌（HCC）的發生。而且，OBI患者是潛在的HBV傳染源，可通過輸血、器官移植和母嬰密切接觸等方式進行傳播。此外，在免疫機能下降或進行免疫抑制治療時，部分OBI患者可出現HBV再激活。所以OBI的檢測和診斷尤為重要。魯鳳民教授團隊認為cccDNA和/或rcDNA的存在均表征了HBV發生病毒再激活和再感染的潛能，實驗室診斷OBI僅需要排除HBV整合DNA片段帶來的干擾，而不必刻意地區分cccDNA和rcDNA。據此他們提出了OBI定義的更新建議：排除HBV感染窗口期，按照現有血清學檢測技術檢測HBsAg陰性，但肝組織中H B V r c D N A或cccDNA（即復制全能性HBV DNA）陽性，對應血清HBV DNA低于檢測下限或低值陽性（ ＜ 200 IU/mL）的 OBI更 新 定義，并建立了單跨缺口PCR體系檢測復制全能性HBV DNA，以期將來用于OBI的臨床診斷，推動OBI人群的診療及管理。

增殖肝細胞膜定位NTCP蛋白表達抑制與慢乙肝患者獲得更佳的病毒學應答相關

有肝臟炎癥損傷的慢乙肝患者與處于免疫耐受期的慢性HBV感染者相比更易于獲得良好的病毒學應答。有文獻報道在感染肝細胞增殖過程中cccDNA會被不斷稀釋和丟失，可能產生cccDNA清除的新生肝細胞，有助于HBV的控制和清除。處于增殖狀態的新生肝細胞對HBV再感染存在抵抗，但機制不清。2012年，鈉離子/牛磺膽酸共轉運蛋白（NTCP）被我國學者鑒定為HBV感染肝細胞的功能性受體。后續研究發現，NTCP表達水平及亞細胞定位與 HBV 感染密切相關。魯鳳民教授團隊發現，細胞膜定位的NTCP低表達可進一步保護那些cccDNA清除的新生肝細胞不被感染。該研究部分闡明了臨床上肝臟炎癥活動度高的慢乙肝患者可以獲得良好病毒學應答的原因，為現行指南推薦的對肝臟有中度以上炎癥的慢乙肝患者進行積極抗病毒治療提供新的理論支持。

通過基因編輯技術探索清除HBV cccDNA的途徑，追求慢乙肝臨床治愈

研發直接靶向cccDNA的藥物，尋找清除cccDNA的新方法和新策略，是當前治療慢乙肝新藥物新技術研發的熱點。魯鳳民教授團隊首先通過HBV特異的雙向導RNAs（guide RNA，gRNA）介導的CRISPR/Cas9系統實現了對cccDNA的高效破壞，進一步通過模擬自然界microRNA（miRNA）的生成過程，研發出了R N A干擾聯合雙gRNAs導向的CRISPR/Cas9技術，在基因轉錄抑制和靶向破壞cccDNA兩個層次上探索HBV cccDNA 清除 新路徑。為了安全有效地將CRISPR/Cas9系統遞送至患者體內并發揮其基因編輯功能，魯鳳民教授團隊探索了細胞來源外泌體傳遞功能性gRNA和Cas9蛋白、實現靶向清除cccDNA 的可能性。實驗證明具有較高安全性的外泌體有可能成為CRISPR/Cas9系統靶向HBV cccDNA的一種安全、有效的遞送方式。

明確了血清高爾基體蛋白73（GP73）的臨床意義

目前肝纖維化、肝硬化的診斷尚缺乏特異度和靈敏度高的“無創”診斷標志物。魯鳳民教授團隊發現血清GP73能夠很好地反映慢性肝病患者中肝纖維化、肝硬化的進展情況，并初步確定了血清GP73對慢乙肝、丙肝及非酒精性脂肪肝等不同病因所致的不同階段肝纖維化、肝硬化的診斷界值。為了提高診斷的準確性，將血清GP73與其他血清學指標進行聯用，建立了適應于我國乙肝肝硬化聯合診斷模型GAPA。應用該診斷模型，患者可通過血清學檢測較為準確地判斷肝纖維化、肝硬化的進程階段，有助于為患者提供有效臨床干預，減少包括肝癌在內的終末期肝病發生。他們還發現，血清GP73不僅與肝纖維化的進程密切相關，與肝臟炎癥活動的情況也是顯著相關。考慮到臨床上仍需要反應肝臟炎癥活動度的微創指標。該團隊與國內學者合作，通過多中心臨床隊列分析發現GP73聯用AST、GGT的HIM模型對中度及以上的肝臟炎癥具有穩定且良好的診斷價值，準確性在90%左右。并且，HIM診斷模型在那些ALT不升高但伴有明顯得肝臟炎癥的慢乙肝患者中仍然展現出良好的診斷效能，這將有助于醫生判斷用藥的時機，及時使患者得到有效的干預。

挖掘肝臟彈力指數在肝臟炎癥中的診斷價值

魯鳳民教授團隊多中心研究結果顯示，在慢乙肝、非酒精性脂肪肝和自身免疫性肝病等慢性肝病中，LSM均隨肝臟炎癥活動度的加重而逐步升高。其中在慢乙肝患者，LSM對中度及以上的肝臟炎癥診斷價值優于ALT和AST。在非酒精性脂肪肝中，遠遠優于ALT。這對有進展風險的非酒精性脂肪肝患者給予及時治療，從而減緩疾病進展和并發癥的發生具有重要意義。

研究論證了血清甲胎蛋白（AFP）在我國HBV感染相關HCC篩查和診斷中的價值

我國80%以上的HCC由HBV感染引起。然而，約2/3的HCC患者在診斷時已處于疾病的中晚期，失去了最佳的治療時機。早期甚至是極早期發現和診斷肝癌，并給予其根治性治療是改善肝癌患者生存預后的關鍵。血清AFP被應用于肝癌患者的臨床檢測中。但血清AFP在活動性肝炎、肝硬化患者中有相當比例的假陽性升高，影響了血清AFP在篩查和診斷肝癌時的靈敏度和特異度，降低了相應的篩查和診斷效能。魯鳳民教授團隊研究發現，經抗病毒治療的患者血清AFP水平會相對較低，而特異度則相應有所提高。據此他們建議，對于接受抗病毒治療的慢乙肝及肝硬化患者，相應地降低血清AFP臨床界值以提高篩查和診斷靈敏度，并聯合超聲等影像學手段以利于早期肝癌的發現。

挖掘影響肝癌患者術后生存的標志物

魯鳳民教授團隊通過對肝癌患者術后隨訪隊列進行分析，發現術前紅細胞計數越高的患者術后生存情況越好，并認為紅細胞計數與肝功能的相關性可能是其能夠反映肝癌患者術后預后情況的主要原因。還發現，血清載脂蛋白B是獨立的肝癌預后因素。血清前白蛋白又被稱為轉甲狀腺素蛋白，主要在肝臟中合成。由于其在體內總量明顯少于白蛋白，半衰期僅1.9天，因此與白蛋白相比，其能更敏感的反映肝臟功能和營養狀況。他們發現肝癌患者術前血清前白蛋白是Child A級患者的預后保護因素，術前前白蛋白高（男性>190 mg/L，女性>170 m g/L）、中（男性120～190mg/L，女性110～170mg/L）和低（男性<120mg/L，女性<110mg/L）組患者的中位生存期分別為49.85、26.25、和11.02個月。并據此構建了新的改良的MCP肝功能評分系統，納入前白蛋白指標后的MCP分級系統的術后生存期預測的精準性遠優于傳統Child-Pugh系統。此外，他們還發現白球比（A/G）較低的患者其肝功能、凝血功能較差，腫瘤進展情況嚴重，其可以作為術前評估預后情況的指標之一，為臨床醫生篩選術后預后較好的患者行肝癌根治術提供了更多參考。

魯鳳民教授團隊在近年的工作中證實了血清中HBV RNA病毒樣顆粒的存在，完善了HBV的復制周期；以血清HBV DNA、RNA雙檢測陰性為指標重新定義了病毒學應答，并結合HBsAg定量（≤1500IU/mL）提出準臨床治愈的概念；明確提出血清HBV RNA檢測可用于評估接受NAs鞏固治療慢乙肝患者的停藥風險，及對特殊NAs經治患者追求臨床治愈的治療路徑建議；以復制全能性HBV DNA （rcDNA/cccDNA）存在與否為依據更新了OBI的定義。此外，有關NTCP在活躍增殖表達抑制和肝細胞膜定位異常的研究使我們認識到，在有明顯活動性肝臟炎癥患者中，一方面cccDNA隨細胞增殖而減少甚至丟失，另一方面肝細胞增殖狀態可使其抵抗HBV再感染和新感染發生，而NAs治療下子代HBV DNA和“HBV RNA病毒樣顆粒”感染缺陷性可進一步減少增殖肝細胞新發感染的發生，使該類患者更易獲得病毒學應答。魯鳳民教授團隊有關GP73的研究為我們提供了一個新的肝臟炎癥、肝硬化相關的血清標志物。上述研究在一定程度上改善了我們的慢性肝病管理，有助于患者獲得更好的治療。