響應面法優化柚皮苷酶對橘紅的脫苦工藝

劉影 甘釗生 張榕欣

摘 要：采用柚苷酶對橘紅進行脫苦研究。以橘紅脫苦率為指標，在單因素試驗的基礎上，采用響應面法優化柚皮苷酶對橘紅的脫苦工藝，確定最佳脫苦條件為：酶解溫度60 ℃、酶解時間2 h、酶用量為0.8%、pH值為4～5，在此條件下脫苦率可達25.1%。

關鍵詞：橘紅;柚皮苷酶;脫苦;響應面法

Abstract：Pummelo Peel was debitterized by naringinase treatment. The response surface method was used for optimizing the conditions of debitterizing based on single factor experiment with the index of debitterizing rate. The results showed that the optimum conditions were as follows： enzyme treatment temperature was 60 ℃， enzyme treatment time was 2 h， enzyme dosage 0.8%， soaking solution pH was 4～5. Under this condition， the debitterizing rate reached 25.1%.

Key words：Pummelo peel; Naringinase; Debitterize; Response surface method

中圖分類號：R284.2

橘紅自古被稱為南方人參，是中國四大南藥和十大廣藥之一。《本草綱目拾遺》記載，橘紅治痰癥、消油膩、消食、醒酒、寬中、解蟹毒。橘紅目前主要被加工為橘紅片、橘紅成藥、橘紅制劑等藥品。橘紅屬藥食同源物品，既可作為藥材也可作為食品，但橘紅苦味強烈，很難將其加工為口感被大眾喜愛的食品。

黃酮類成分是橘紅的主要有效成分之一[1]，其中柚皮苷占總黃酮含量的80%以上[2]，可達到橘紅重量的7.87%[3]，柚皮苷苦感強烈，在水里的苦味閾值為20 mg·L-1[4]。柚皮苷的去除方法主要有吸附法、屏蔽法、酶法等，其中酶法脫苦專一性強，是較為理想的脫苦方法[5]。目前已有關于柚苷酶對柚子汁、柚子皮、柑橘果汁、金桔汁等的脫苦研究，暫未見橘紅的脫苦研究。本研究首次利用柚皮苷酶對橘紅進行脫苦，并通過響應面法優化脫苦工藝，以期將橘紅開發為口感接受度高的食品，從而推動橘紅產業的進一步發展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料。橘紅，采摘于廣東省化州市;柚皮苷標準品，購自sigma公司;柚皮苷酶（食品級），購自上海瑞豐實業有限公司;檸檬酸、二甘醇、氫氧化鈉等試劑均為分析純。

儀器。高速萬能粉碎機（型號：FW-100，天津市泰斯特儀器有限公司）;數顯恒溫水浴鍋（型號：DK-98-IIA，天津市泰斯特儀器有限公司）;電子天平[型號：ME-104，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司];紫外可見分光光度計（型號：UV-1800PC，上海美譜達儀器有限公司）;pH計（型號：pHS-3C，上海精密雷磁公司）。

1.2 橘紅脫苦干燥處理

新鮮橘紅于沸水中燙漂2～3 min，切成長20～30 mm、寬5～10 mm、厚1.0～2.0 mm片狀，加入一定濃度的柚苷酶溶液，在一定溫度和pH條件下脫苦一定時間，漂洗10 min，瀝干水分，在70 ℃恒溫鼓風條件下烘干8 h，粉碎，過100目篩，待用。

1.3 柚皮苷含量測定

采用Davis[6-7]法對橘紅中柚皮苷含量進行測定。

1.3.1 繪制標準曲線

稱取干燥至恒重的柚皮苷標樣100.0 mg，添加0.1 mol·L-1的NaOH使其完全溶解，用檸檬酸調節pH值到6，定容至250 mL，得到柚皮苷標準儲備液。將標準儲備液稀釋5倍得到溶度0.08 mg·mL-1的標準使用液，同時以空白液作標準稀釋用。分別吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0 mL和5.0 mL標準使用液于6支具塞試管中，分別添加空白液5.0、4.0、3.0、2.0、1.0 mL和0.0 mL，各加入90%二甘醇5.0 mL和4 mol·L-1

NaOH溶液0.1 mL，置于40 ℃水浴中顯色10 min，立即在420 nm波長下測量吸光度。以柚皮苷含量為橫坐標，以吸光度為縱坐標作圖，得到標準曲線方程為Y=3.127 9X+0.005 1，R?=0.997。

1.3.2 樣品測定

①取一定量橘紅粉末，加入0.1 mol·L-1NaOH溶液50 mL，用4 mol·L-1 NaOH溶液調節pH至12，浸泡30 min，用檸檬酸溶液調節pH至6，定容到250 mL。

過濾，收集澄清液，備用。②分別移取樣液0.50 mL于2支具塞試管，加試劑空白液至5 mL，分別加90%二甘醇5 mL，各加4 mol·L-1NaOH溶液0.0 mL和0.1 mL，置于40 ℃水浴中顯色10 min，立即在420 nm

波長處測量吸光度，用加堿管的吸光值減去不加堿管的吸光值，通過標準曲線回歸方程算出所取樣液中柚皮苷含量毫克數。

1.3.3 橘紅中柚皮苷含量

（1）

式（1）中：A-由待測液吸光值通過標準曲線計算所得的柚皮苷含量，單位mg;V1-樣品測定時定容的總體積，單位mL;V2-移取的待測液體積，單位mL;m-樣品稱取的質量，單位g。

1.3.4 脫苦率計算

脫苦率以水解柚皮苷的程度表示。

1.4 單因素試驗

以橘紅脫苦率為考查對象，選取柚苷酶的用量、酶解的溫度、酶解的時間和酶解的pH4個影響柚苷酶脫苦效果的主要因素進行單因素試驗研究。

1.5 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，結合實際試驗操作，選取酶解溫度（A）、酶解時間（B）和酶用量（C）對脫苦率影響較大的3個因素為進一步研究對象，根據Box-Behnken中心組合實驗原理，設計三因素三水平的響應面分析試驗方案，試驗方案見表1。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶解溫度對脫苦效果的影響

各稱取燙漂切片的橘紅100 g，在pH值4.0的溶液中加入0.6%的柚苷酶，分別于30、40、50、60 ℃和70 ℃條件下脫苦1.0 h，測定反應溫度對脫苦率的影響。由圖1可知，柚皮苷酶的脫苦效果受溫度的影響較大，在30～60 ℃溫度范圍內，隨著溫度的升高柚皮苷酶對橘紅的脫苦效果明顯上升，當溫度超過60 ℃

后，脫苦效果隨著溫度的升高反而降低，說明溫度過低，酶活力低會降低對橘紅的脫苦效果;溫度過高，酶蛋白會發生變性，影響酶活力，也會降低脫苦效果[8-9]。

試驗結果表明脫苦的適合溫度范圍為50～65 ℃，此時脫苦效果較好。

圖1 酶解溫度對橘紅脫苦率的影響圖

2.1.2 酶解時間對脫苦效果的影響

各稱取燙漂切片的橘紅100 g，在pH值4.0的溶液中加入0.6%的柚苷酶，于50 ℃條件下分別脫苦0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h和3.0 h，測定反應時間對脫苦率的影響。由圖2可知，在其他條件一定的情況下，隨著酶作用時間的增加，脫苦率逐漸增大，在2 h前上升較快，2 h后的上升速率明顯下降，2.5 h后幅度基本保持不變，可能是因為在酶解反應前期，柚皮苷底物含量高，酶解速率高，隨著時間的延長柚苷酶發生變性，酶解反應幾乎停止，因此脫苦率基本保持不變[10-11]。為提高生產效率，在保證脫苦率的前提下，酶解時間應越短越好。試驗結果表明脫苦時間以2 h為佳。

圖2 酶解時間對橘紅脫苦率的影響圖

2.1.3 酶添加量對脫苦效果的影響

各稱取燙漂切片的橘紅100 g，在pH值4.0的溶液中分別添加0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.2%、1.6%和2.0%的柚苷酶，于50 ℃條件下脫苦1.0 h，測定酶添加量對脫苦率的影響。由圖3知，脫苦率隨著酶添加量的增加先升高后降低，在添加0.8%的柚苷酶時脫苦率達到最大值，可能是由于當酶濃度較低時，酶解反應與酶的濃度成正比。當酶濃度過高時，底物濃度相對較低，酶與底物接觸機會下降，同時存在競爭性抑制作用，導致脫苦率降低[9-10]。綜合考慮，酶用量為0.6%～1.0%范圍內脫苦效率較好。

圖3 酶添加量對橘紅脫苦率的影響圖

2.1.4 酶解pH對脫苦效果的影響

各稱取燙漂切片的橘紅100 g，分別在pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的溶液中添加0.6%的柚苷酶，于50 ℃條件下脫苦1.0 h，測定溶液pH值對脫苦率的影響。由圖4知，用柚皮苷酶對橘紅進行脫苦，當溶液的pH值在4以下時，隨著pH值的增加脫苦率明顯增大;當溶液的pH值在5以上時，隨著pH值的增加脫苦率降低;溶液pH值在4～5時脫苦率較高且比較穩定。說明酶對底物進行作用時，有其適宜的pH值范圍，若不在酶作用的最適pH值范圍，酶本身的活性將受到影響，發揮不了對底物應有的作用[11]。因此用柚皮苷酶對橘紅進行脫苦時，pH值在4～5的范圍內，效果較好。

圖4 酶解pH對橘紅脫苦率的影響圖

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面試驗方案及結果

以橘紅脫苦率為考查指標，通過Design Expert軟件進行響應面試驗設計，共有17個試驗方案，其中12個試驗為析因試驗，5個試驗為中心試驗用來估算誤差。試驗方案及結果如表2所示。

2.2.2 回歸方程的建立及方差分析

運用Design Expert軟件對表2試驗結果進行多元回歸擬合，建立二次多項式回歸模型。以橘紅脫苦率（Y）為目標函數的回歸方程為：

Y=24.38+0.62A+0.38B+0.23C-0.57BC-0.60A2-0.65B2-0.31C2

通過方差分析和相關系數可考察模型的可靠性，結果見表3。

模型的P值<0.000 1，表明二次方程擬合顯著。失擬項P值0.528 5>0.05，表明失擬項相對于絕對誤差不顯著。模型的決定系數R2=0.939 6，說明模型的響應值，即橘紅脫苦率變化的93.96%來源于所選變量，即柚苷酶用量、酶解時間和酶解溫度。因此，此模型與試驗數據擬合程度和可信度較高，可利用此回歸方程確定橘紅的最佳脫苦工藝條件。

回歸方程方差分析中各變量的P值表明：一次項A，一次項B，交互項BC，二次項A2和B2對橘紅脫苦率（Y值）的影響極顯著（P<0.01），一次項C和二次項C2對橘紅脫苦率（Y值）的影響顯著（P<0.05）。說明各個試驗因素對橘紅脫苦率的影響不是簡單的線性關系。3個影響因素中，對橘紅脫苦率影響最大的為酶解溫度，其次為酶解時間，影響最小的為酶添加量。

2.2.3 響應面分析

各試驗因素的交互作用對橘紅脫苦率（Y值）的影響如圖5、圖6、圖7所示。由圖5可知，橘紅脫苦率隨著各因素水平的增大先增大后減小。由等值線圖可知，擬合面脫苦率存在最高值，說明各因素都有一個對應的最適值存在。

其中，圖7的響應面較陡峭，說明酶解時間和酶添加量二者間的交互作用是極顯著的。而圖5和圖6的響應面較緩，說明酶解溫度和酶添加量、酶解溫度和酶解時間的交互作用對脫苦率的影響相對較小，符合方差分析的結果。

2.2.4 橘紅脫苦工藝的確定與驗證

通過回歸方程預測出橘紅脫苦的最佳工藝條件為柚苷酶用量0.832%，酶解時間2.11 h，酶解溫度61.325 ℃。在此條件下，脫苦率在理論上可達到24.6 %。

為方便實際操作，對預測得到的理論條件進行微調，即：酶解溫度為60 ℃，酶解時間為2 h，酶用量為0.8%。在此條件下重復3次脫苦試驗以驗證模型的有效性。3次試驗的平均脫苦率為25.1%，與預測值24.6%相比，其相對誤差為2.0%。說明采用響應面試驗得到的柚皮苷酶對橘紅脫苦的工藝參數是可靠的，具有一定的實際價值。

3 結論

采用柚皮苷酶對橘紅進行脫苦，根據單因素試驗的結果，以酶添加量、酶解時間、酶解溫度為自變量，以橘紅脫苦率為響應值，通過響應面法優化橘紅酶法脫苦最佳工藝條件為酶解溫度60 ℃、酶解時間為2 h、酶用量為0.8%，在此條件下脫苦率可達25.1%。

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