高效液相色譜法快速測定三種果蔬中甲苯氟磺胺和苯氟磺胺殘留量

吳麗，周書來

（1.樂山市食品藥品檢驗檢測中心，四川樂山 614000；2.樂山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川樂山 614000）

食用農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全是食品安全的源頭，也是從農(nóng)田到餐桌的第一道防線。近年來，國家不斷加大對食用農(nóng)產(chǎn)品的抽檢力度，“十三五”食品安全規(guī)劃要求主要針對農(nóng)藥、獸藥殘留的食品檢驗量不低于每年2 份/千人。眾多研究發(fā)現(xiàn)，影響果蔬類質(zhì)量安全的因素主要有農(nóng)藥殘留、重金屬和食源性致病微生物等，其中農(nóng)藥殘留問題最為突出，它不僅會給健康帶來一定的風(fēng)險，還可能會影響國際貿(mào)易[1-3]。

甲苯氟磺胺和苯氟磺胺均為廣譜型殺菌劑，中等毒性，主要用于防治柑桔、葡萄、黃瓜等果蔬的真菌性病害。德國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)甲苯氟磺胺的分解產(chǎn)物可轉(zhuǎn)化為有毒物質(zhì)亞硝胺，亞硝胺可對水資源產(chǎn)生污染，歐盟已經(jīng)發(fā)布限令禁止使用甲苯氟磺胺類殺菌劑[4-5]。國際食品法典委員會也將二者列入了2015～2019 年農(nóng)藥評估優(yōu)先列表[6]。現(xiàn)行國標(biāo)規(guī)定了番茄、黃瓜、萵苣、草莓、葡萄等多種果蔬中苯氟磺胺和甲苯氟磺胺的殘留限量，其指定的檢測方法均為氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7-9]，該法操作復(fù)雜、儀器普及率不高，且適用范圍僅為蘋果、柑桔、葡萄、甘藍(lán)、芹菜和西紅柿這6 種果蔬，未能涵蓋所有對甲苯氟磺胺類和苯氟磺胺有限量要求的品種。目前也尚無采用高效液相色譜法對兩者物質(zhì)的殘留量進(jìn)行測定的研究[10-11]。本文采用改進(jìn)后的QuEChERS 方法提取凈化，將乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相，以梯度洗脫的方式，采用實(shí)驗室普及率較高的高效液相色譜（二極管陣列檢測器）檢測二者殘留量。方法操作簡便、快速、分離度好、結(jié)果準(zhǔn)確，能很好地應(yīng)用于黃瓜、葡萄和番茄等幾種常見果蔬中甲苯氟磺胺和苯氟磺胺殘留的定量檢測。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

甲苯氟磺胺（99.32%）、苯氟磺胺（99.0%），德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；C18 粉、PSA 粉及石墨炭黑粉，Agela Technologies；乙腈（色譜純），北京百靈威科技有限公司；無水氯化鈉（分析純）、無水硫酸鎂（分析純，用前在500 ℃馬弗爐內(nèi)烘5 h，冷卻后取出裝瓶備用），成都市科龍華試劑廠。

番茄、黃瓜、葡萄鮮樣，均為市售。

1.2 儀器與設(shè)備

小型高速粉碎機(jī)，永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司；CP225D 電子天平，德國賽多利斯公司；TG-16 臺式高速離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司；IKA T25 組織搗碎勻漿儀，江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；UPT-Ⅱ-10T 超純水機(jī)，四川優(yōu)普超純科技有限公司；TU-1901 紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Thermo Ultimate 3000 高效液相色譜儀，Thermo SCIENTIFIC。

1.3 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精密稱取甲苯氟磺胺標(biāo)準(zhǔn)品11.62 mg、苯氟磺胺標(biāo)準(zhǔn)品10.68 mg，置于同一個100 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，即得混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備溶液。

精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備溶液1 mL，置10 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

1.4 樣品前處理

分別取新鮮果蔬（番茄、黃瓜、葡萄）樣品，粉碎均勻，稱取10 g（精確至0.1 g）試樣，置于50 mL 塑料離心管中，加入20 mL、1%甲酸-乙腈，加蓋超聲提取30 min，往離心管中加入4 g 無水氯化鈉、5 g 無水硫酸鎂，加蓋振搖2 min，然后在組織搗碎勻漿儀上以15 000 r/min 勻漿提取1 min，再以5 000 r/min 離心5 min，準(zhǔn)確移取10 mL 上清液于50 mL 離心管中，離心管中預(yù)先加入750 mg 無水硫酸鎂、250 mgPSA、50 mgC18 和50 mgGCB，加蓋渦旋振蕩1 min，再以5 000 r/min 離心5 min，準(zhǔn)確移取5.00 mL 上清液在50 ℃下氮?dú)獯抵两桑尤?.0 mL乙腈渦旋溶解殘渣，經(jīng)0.45 μm 有機(jī)微孔濾膜過濾，進(jìn)行HPLC 分析。

1.5 色譜條件

色譜柱：德國MN MACHEREY-NAGEL C18 不銹鋼柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動相：A 為乙腈，B 為0.1%甲酸水溶液。梯度洗脫程序：0～1.0 min，40%B；1.0～17.0 min，40%～20%B；17.0～23.0 min，20%～20%B；23.0～25.0 min，20%～40%B。流速：1.0 mL/min。柱溫：30 ℃。進(jìn)樣體積：10 μL。檢測波長：205 nm。外標(biāo)峰面積法定量。

1.6 方法學(xué)考察

1.6.1 線性范圍

分別準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備溶液0、0.1、0.25、0.5、2.5、5 mL 至10 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。經(jīng)0.45 μm 有機(jī)微孔膜過濾后進(jìn)行HPLC 分析，以濃度c（μg/mL）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察線性范圍。

1.6.2 方法檢出限與定量限

精密量取混合對照品溶液，加溶劑稀釋成系列濃度的溶液，按1.5 項下的色譜條件進(jìn)樣分析。以3 倍信噪比計算檢出限，以10 倍信噪比計算定量限。

1.6.3 精密度

精密量取混合對照品溶液，按1.5 項下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）。

1.6.4 回收率與重復(fù)性

準(zhǔn)確稱取粉碎黃瓜、番茄和葡萄陰性樣品，分別添加甲苯氟磺胺和苯氟磺胺5.0、7.5、10 mg/kg 這三個低、中、高水平濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平設(shè)置6 個平行，按1.4項的方法進(jìn)行前處理，1.5 項的方法進(jìn)樣分析，考察回收率與重復(fù)性，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）。

2 結(jié)果與分析

2.1 波長的確定

目前尚無高效液相色譜法測定果蔬中甲苯氟磺胺和苯氟磺胺殘留量的相關(guān)報道，波長的確定無相關(guān)參考文獻(xiàn)。現(xiàn)將甲苯氟磺胺和苯氟磺胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行190～800 nm 光譜掃描，結(jié)果見圖1。由圖1 可知，甲苯氟磺胺和苯氟磺胺在203、205 nm 處為波峰，響應(yīng)值最大，因此選取205 nm 作為測定波長。

2.2 線性范圍、方法檢出限和定量限

方法的線性范圍、方法檢出限和定量限檢測結(jié)果見表1。由表1 可知，甲苯氟磺胺在0～57.70 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為A=0.471c-0.109 3（R2=0.999 9），檢出限為12.6 μg/kg，定量限為41.9 μg/kg。苯氟磺胺在0～52.87 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為A=0.420 8c-0.092 5（R2=0.999 9），檢出限為15.1 μg/kg，定量限為50.2 μg/kg。

表1 線性范圍和檢出限Table 1 Linear range and detection limit

表2 陰性樣品的加標(biāo)回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 2 Spiked recovery and RSD of the negative samples(n=6)

2.3 回收率與重復(fù)性

陰性樣品及加標(biāo)樣品色譜圖見圖2（C）、圖2（D），標(biāo)準(zhǔn)峰與雜質(zhì)峰實(shí)現(xiàn)了很好的分離。各添加水平平均回收率結(jié)果如表2 所示，由表可知，甲苯氟磺胺平均回收率為86.46%～97.39%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.98%～4.21%；苯氟磺胺平均回收率為79.73%～91.52%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.68%～4.19%。該結(jié)果表明本試驗所用方法的回收率與重復(fù)性均能滿足測定要求。

2.4 精密度

經(jīng)計算，該方法中甲苯氟磺胺精密度的RSD為0.9%，苯氟磺胺的RSD為0.6%，可見，該方法的精密度良好。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

根據(jù)甲苯氟磺胺和苯氟磺胺結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和相關(guān)資料，考察了乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液兩種常見流動相體系和洗脫方式對目標(biāo)化合物的影響。結(jié)果顯示，目標(biāo)化合物在兩種流動相體系中峰形均較好，但甲醇在205 nm 處有末端吸收，干擾較大。本文還考察了洗脫程序?qū)δ繕?biāo)化合物出峰的影響，在等度洗脫的條件下20 min 內(nèi)不能洗脫出峰，最終確定采用乙腈－0.1%甲酸水溶液作為流動相，以梯度洗脫的方式進(jìn)行分析，結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)峰型對稱、峰寬較窄，如圖3 所示。

3.2 樣品預(yù)處理條件的優(yōu)化

參閱相關(guān)文獻(xiàn)[12]，本文對提取溶劑乙腈和1%甲酸-乙腈（v/v）進(jìn)行了考察。試驗結(jié)果表明，以回收率為指標(biāo)，1%甲酸-乙腈作為提取溶劑時對三種果蔬中目標(biāo)化合物的回收率均高于以乙腈作為提取溶劑時的回收率，故選取1%甲酸-乙腈為提取溶劑。

本文測試的三種果蔬，其含水量、含酸量及含色素量均較高，根據(jù)樣品特點(diǎn)采用QuEchERS 法對樣品進(jìn)行前處理。本試驗對QuEchERS 法中的凈化劑種類和用量組合進(jìn)行了考察，使用的凈化劑有無水硫酸鎂、C18、PSA和GCB。無水硫酸鎂主要去除提取溶劑中多余的水分；C18 主要去除基質(zhì)中的脂肪和蠟狀物；PSA 主要去除脂肪酸、有機(jī)酸、糖類和極性色素；GCB 主要去除色素，對一些含有芳香環(huán)的化合物也有影響。樣品提取后再離心取上清液觀察凈化效果，同時考察回收率。結(jié)果表明，PSA 和GCB 用量較高時，均會降低回收率，組合用量較少時，提取液中雜質(zhì)較多，導(dǎo)致雜峰多易干擾。最終確定吸附劑組合用量為750 mgMgSO4+50 mgC18+250 mgPSA+50 mgGCB，該組合對樣品進(jìn)行凈化處理后，上清液澄清，略帶色澤，化合物平均回收率在79%以上。

4 結(jié)論

QuEChERS 是檢測機(jī)構(gòu)大批量樣品前處理的一種常用方法，主要應(yīng)用于含水量較多的果蔬類樣品基質(zhì)，該法快速、簡單、有效，實(shí)用價值高，多見于氣相色譜法或氣質(zhì)色譜法檢測果蔬樣品的前處理[13-14]。近年來已有學(xué)者對其在高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測中的應(yīng)用進(jìn)行了研究[15-17]。本文在此基礎(chǔ)上，結(jié)合樣品特性，對凈化劑組合用量進(jìn)行了適當(dāng)調(diào)整，將QuEChERS 前處理技術(shù)與高效液相色譜法相結(jié)合，建立了一種測定葡萄、番茄、黃瓜中甲苯氟磺胺和苯氟磺胺殘留量的新方法。基于之前并無高效液相色譜法測定甲苯氟磺胺和苯氟磺胺殘留量的相關(guān)報道，本研究對色譜條件進(jìn)行了全面考察，以乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，實(shí)現(xiàn)了對標(biāo)準(zhǔn)峰型的優(yōu)化和與雜質(zhì)峰的分離。該方法操作簡便、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，能很好地滿足幾種果蔬中甲苯氟磺胺和苯氟磺胺殘留量的分析檢測。