高溫米糠粕中蛋白質的提取工藝優化

楊華，宣麗*，權志中，楊寧，梁麗萍，宗緒巖

（1.沈陽市現代農業研發服務中心<沈陽市農業科學院>，遼寧 沈陽 110025；2.沈陽市康普利德生物科技有限公司，遼寧 沈陽 110161；3.遼寧康普利德生物科技有限公司，遼寧 鐵嶺 112600；4.四川輕化工大學生物工程學院，四川 宜賓 644000）

米糠是指糙米碾下的皮層，蛋白質含量一般在12%～15%[1]。米糠粕是米糠經浸出、脫脂處理后的產物，蛋白含量在15%以上，通過加熱膨化、浸取油脂處理可以在保留米糠營養特性、滅活抗營養因子的同時延長保質期[2]。因此，米糠粕更適合作為綜合開發利用的原料。高溫米糠粕是米糠經過高溫提油之后的副產品。目前世界上每年生產米糠油50 萬t，中小企業生產米糠油時采用高溫提油工藝，而且米糠容易氧化酸敗，在4～6 h 內必須進行加工達到熱穩定化，因此市面上大部分的米糠粕屬于高溫粕[3]。

米糠粕在熱穩定化加工過程中蛋白質容易發生變性，導致可溶性蛋白減少，給米糠蛋白的提取帶來困難。國內外已有大量關于米糠深加工的研究報道[4]，例如從米糠中直接提取功能性物質制備功能性食品、利用微生物發酵米糠實現其增值轉化，但鮮有關于高溫米糠粕綜合利用的研究。目前，米糠蛋白的提取方法主要有堿法、物理法、酶法以及物理法結合酶法[5]。其中，堿法提取是公認的工藝簡便、提取率較高的一種方法[6]。超聲波提取法具有提取效率高、操作方便、溫度低、提取時間短等優點[7]。酶法反應條件溫和、蛋白提取得率較高，且能更多地保留蛋白質的營養價值[5]。馬永強等[8]的研究表明，堿性蛋白酶對高溫米糠粕的水解效果較為突出；李東銳等[9]研究發現，超聲波處理有助于米糠粕中米糠蛋白的提取，超聲功率的變化對米糠蛋白的提取率影響不大，而超聲處理時間影響相對較大，處理20 min 時蛋白提取率達到最大。

前期試驗通過各活性物質提取順序的研究，確定了適宜高溫米糠粕綜合利用的工藝順序，即提取植酸鈣→糖化酶除淀粉→提取蛋白質→提取多糖。此工藝順序不僅最大程度避免了各活性物質間的相互影響，而且提高了蛋白質和多糖的質量[10]。本試驗以提取植酸鈣、除淀粉后的高溫米糠粕為原料，分別采用堿法、堿法-物理法（超聲波）、堿法-物理法-酶法（超聲波+堿性蛋白酶）三種方法提取蛋白質，以期在相對溫和的反應條件下優化蛋白質的提取工藝，從而為高溫米糠粕的綜合開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠粕：采購于沈陽金稻飼料有限公司。

硫酸銅、硫酸鉀、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、硼酸、糖化酶、堿性蛋白酶（活力2.0×105U/g）、濃硫酸、濃鹽酸、碘、碘化鉀、氫氧化鈉等試劑，均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1700 型紫外可見分光光度計，日本島津公司；HJ-M6 型水循環磁力攪拌水浴鍋，金壇市城西春蘭實驗儀器廠；STARTER 3100 型pH 計，上海奧豪斯儀器有限公司；CP 214 型電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；K9860 型全自動凱氏定氮儀，海能儀器；SC-3614 型低速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；101FA-0 型電熱鼓風干燥箱，上海樹立儀器儀表有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 米糠粕前處理

（1）提取植酸鈣

按照料液比1：10（g：mL），在室溫下提取1 h，提取溶劑為1 mol/L 鹽酸，對米糠粕進行處理。提取結束后，離心，沉淀備用。

（2）糖化酶除淀粉

將1.3.1（1）中的沉淀，按照糖化酶添加量2%（糖化酶質量/米糠粕原料質量），料液比1：10（按米糠粕原料的質量計），溫度60 ℃，pH 4.0～4.5，酶解4 h 進行處理，滅酶，離心，沉淀備用。

1.3.2 米糠粕蛋白提取

（1）米糠粕蛋白堿法提取

1.3.1（2）中的沉淀→按照料液比1：10（按米糠粕原料的質量計）加入蒸餾水→調節適當pH→水浴溫度50 ℃，攪拌時間2 h→4 000 r/min 離心10 min，所得上清液處理方式分為步驟①②。

步驟①上清液用1 mol/L 鹽酸調pH 為3.6[8]→靜置過夜→10 000 r/min 離心10 min→取沉淀物→干燥。

步驟②沉淀物繼續在料液比為1：10 的水中、適當的pH 值溫度50 ℃條件下，2 h 分別提取2 次、3 次→4 000 r/min 離心10 min →上清液處理方法同步驟①。

（2）米糠粕蛋白不同提取方法的比較

堿法：料液比1：10，pH 值為11，提取溫度50 ℃，提取時間4 h。

堿法+超聲波：料液比1：10，pH 值為11，超聲功率60 W，超聲時間20 min，超聲提取結束后，水浴提取溫度50℃，提取時間4 h。

堿法+超聲波+堿性蛋白酶：料液比1：10，pH 值為11，超聲功率60 W，超聲時間20 min，超聲提取結束后采用酶法提取，堿性蛋白酶添加量2.5%，提取溫度50 ℃，提取時間4 h。

提取結束后，滅酶，離心，上清液用1 mol/L 的鹽酸調整pH 為3.6，靜置過夜，沉淀離心后干燥，即得蛋白質樣品。

1.3.3 堿法+超聲波+堿性蛋白酶提取米糠蛋白的單因素試驗

在研究中發現，米糠粕具有較強的pH 緩沖作用，另外隨著酶解作用的進行，樣品pH 值也會發生變化，所以本試驗以酶解反應結束后，蛋白提取液的pH 值作為監測指標，研究不同酶解工藝對米糠蛋白提取效果的影響。

（1）堿性蛋白酶添加量對米糠蛋白得率的影響

精確稱取50.0 g 米糠粕若干份，首先按照1.3.1 項進行前處理，離心后的沉淀分別加入500 mL 蒸餾水，用10%氫氧化鈉調樣品pH 值為11，超聲功率60 W，超聲時間20 min，超聲提取結束后進行酶法提取，堿性蛋白酶添加量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，溫度50 ℃，提取時間3 h。提取結束后，滅酶，離心，上清液測定pH 值，然后用1 mol/L 鹽酸調pH 為3.6，靜置過夜，沉淀離心后干燥，即得蛋白質樣品，然后計算蛋白質得率。

（2）堿性蛋白酶酶解時間對米糠蛋白得率的影響

堿性蛋白酶添加量為1.5%，溫度50 ℃，提取時間分別為1、2、3 h。采用堿法+超聲波+堿性蛋白酶提取米糠蛋白，即得蛋白質樣品，然后計算蛋白質得率。

（3）酶解結束后pH 值對米糠蛋白得率的影響

精確稱取50.0 g 米糠粕若干份，首先按照1.3.1 項進行前處理，離心后的沉淀分別加入500 mL 蒸餾水，樣品pH 值在堿性范圍內呈現梯度，以保證酶解后pH 值分別為7.5、8.5、9.5、10.5、11.5，超聲功率60 W，超聲時間20 min，超聲提取結束后酶法提取，堿性蛋白酶添加量1.5%，提取溫度50 ℃，提取時間1 h。提取結束后，滅酶，離心，上清液測定pH 值，然后用1 mol/L 鹽酸調pH 為3.6，靜置過夜，沉淀離心后干燥，即得蛋白質樣品，然后計算蛋白質得率。

1.3.4 堿法+超聲波+堿性蛋白酶提取米糠蛋白的正交試驗

在單因素試驗的基礎上，進行L9(33)正交試驗，試驗設計見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 The factor and level table of orthogonal test

1.3.5 米糠蛋白的測定方法

采用GB5009.5《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法測定米糠蛋白樣品中蛋白質的含量。按照公式（1）計算蛋白質得率，按照公式（2）計算蛋白提取率。

表2 pH 和提取次數對米糠蛋白得率的影響Table 2 The effect of pH and extraction time on the yield of rice bran protein

式中：m1為蛋白質樣品質量，g；m2為原料質量，g。

式中：m3為米糠蛋白樣品得率，%；m4為米糠蛋白樣品的蛋白含量，%。

1.3.6 數據分析及處理

使用IBM SPSS Statistics 20 軟件分析和處理數據。

2 結果與分析

2.1 米糠粕蛋白堿法提取

由表2 可以看出，pH 對米糠蛋白提取有較大影響。pH 值為8 時，第1 次提取，得率僅為0.12%；pH 值為9時，第1 次提取，得率提高到0.58%；pH 值為10 時，第1次提取，得率提高到1.28%，超過了pH 值為8 時3 次提取的蛋白得率總和；pH 值為11 時第1 次提取，得率提高到1.83%，超過了pH 值為9 時3 次提取的蛋白得率總和。因此后續試驗選擇pH 值為11。

可見，通過增加提取次數和調整pH 值，也僅使米糠蛋白的得率從0.12%提高到2.90%，考慮到增加提取次數會大量增加生產成本，降低提取效率，而且對于經熱穩定化浸提米糠油的糠粕，堿法的提取效率也會大打折扣[11]，所以對高溫米糠粕進行不同提取技術的復合處理很有必要。

2.2 米糠粕蛋白不同提取方法的比較

由表3 可以看出，超聲波輔助堿法提取較堿法提取，蛋白得率提高了0.22%，堿法+超聲波+堿性蛋白酶較堿法提取，蛋白得率提高了2.00%。雖然堿法+超聲波+堿性蛋白酶提取的蛋白含量有所下降，但蛋白提取率還是高于堿法0.61%、高于堿法+超聲波法0.48%。故高溫米糠粕綜合利用研究中，蛋白質的提取方法選擇堿法+超聲波+堿性蛋白酶法。

表3 不同提取方法對米糠蛋白提取效果的影響Table 3 The effect of extraction methods on the yield of rice bran protein

2.3 堿法+超聲波+堿性蛋白酶提取米糠蛋白的單因素試驗

2.3.1 堿性蛋白酶添加量對米糠蛋白得率的影響

由圖1 可以看出，蛋白得率一方面和堿性蛋白酶的添加量有關，另一方面和酶解反應結束后的pH 值有關。酶解反應結束后的pH 值越低，蛋白得率相對越低，當堿性蛋白酶添加量分別為1.0%、1.5%、2.0%時，蛋白得率相對較高，因此，選擇這三個水平進行正交試驗。

2.3.2 堿性蛋白酶酶解時間對米糠蛋白得率的影響

由圖2 可以看出，隨著酶解時間的延長，蛋白得率先升高后下降，在酶解時間為2 h 時，蛋白得率最高，為4.31%，而酶解后pH 值隨著酶解時間的延長呈現下降趨勢，因此，選擇堿性蛋白酶的最佳酶解時間為2 h。

2.3.3 酶解結束后pH 值對米糠蛋白得率的影響

圖3 顯示了酶解結束后不同pH 值對米糠蛋白得率和含量的影響。由圖3 可以看出，酶解反應結束后，蛋白提取液的pH 值越高，蛋白得率越高，蛋白含量也越高。隨著pH 值從7.5 增加到11.5，蛋白得率從2.56%提高到6.16%，蛋白含量從57.5%提高到70.0%。雖然隨著酶解后pH 的增加，蛋白得率一直呈現上升趨勢，但堿液濃度過高，蛋白質中賴氨酸與丙氨酸、胱氨酸易發生縮合反應，生成有毒化合物，使賴氨酸營養價值大幅降低[5]。為了兼顧蛋白得率和營養，選擇酶解后pH 值10.5、11.0、11.5 這三個水平進行正交試驗。

2.4 堿法+超聲波+堿性蛋白酶提取米糠蛋白正交試驗

在單因素試驗的基礎上，進行正交試驗，結果見表4，方差分析結果見表5。

從表4、5 中的數據分析可知，三個因素均是影響米糠蛋白得率的極顯著因素，影響順序依次為酶解時間>蛋白酶添加量>酶解后pH 值；提取米糠蛋白的最佳條件是A2B1C2，即蛋白酶添加量1.5%、酶解時間1 h、酶解后pH 值11.0。經驗證試驗，該條件下得到的米糠蛋白得率為7.10%，高于其他試驗組；此時蛋白含量為70.5%。本試驗通過工藝優化，使米糠蛋白在獲得高得率的同時保證了較高的蛋白含量。

表4 正交試驗結果Table 4 Results of orthogonal test

表5 正交試驗方差分析Table 5 The variance analysis of orthogonal test

3 討論

高溫米糠粕中的可溶性蛋白比例較低，其氮溶解指數（Nitrogen soluble index，NSI）僅為11.6%，屬高變性蛋白[12]。在本研究中也發現米糠蛋白未優化提取條件之前，得率僅為0.12%，這限制了其工業化生產和應用。本文通過優化堿法+超聲波+堿性蛋白酶的提取工藝，確定了高溫米糠粕綜合利用工藝中米糠蛋白的最優提取條件為堿性蛋白酶添加量1.5%、酶解時間1 h、酶解后pH 值11.0。三個因素均是影響米糠蛋白得率的極顯著因素，影響順序依次為酶解時間>蛋白酶添加量>酶解后pH 值。在此條件下，米糠蛋白得率為7.10%，蛋白含量為70.5%。

王丕新[13]通過考察歐美幾個稻谷加工廠，以及日本、韓國等發達國家米糠蛋白制取的先進工藝，也整理出工業化米糠蛋白制取的工藝為兩次堿液浸出，他提出，未來有望在米糠蛋白制取工藝方面，結合酶法和高溫噴射蒸煮等更先進的技術方法來實現米糠蛋白的全面工業化制取。他還指出，工業化生產米糠蛋白的原料為低溫脫脂米糠，限制了高溫米糠粕的應用。本文的研究證實了堿法+超聲波+堿性蛋白酶法提高高溫米糠粕蛋白提取率的可行性。有研究表明，熱穩定米糠粕蛋白經堿性蛋白酶酶解后，蛋白的溶解度、乳化性、乳化穩定性、起泡性和泡沫穩定性均有所提高[14]。在此基礎上，下一步需要確定不同提取工藝對米糠蛋白功能性的影響，從而為米糠蛋白的應用提供理論依據。