VDR 基因多態性與耐多藥肺結核的關聯

劉 幸，孫 輝，杜映榮，陳 潔，歐陽兵，張 樂

（1）昆明市第三人民醫院藥劑科，云南昆明 650041；2）重癥醫學科；3）結核科，云南昆明 650041）

耐多藥肺結核（multi-drug resistant tuberculosis，MDR-PTB）是指至少對異煙肼和利福平兩種一線抗結核藥物同時產生耐藥性的肺結核，2017 年世界衛生組織（world health organization，WHO）報道，全世界MDR-PTB 的治愈率為54%，死亡率高達16%，我國的MDR-PTB治愈率僅有41%，我國也是全世界30 多個耐多藥結核病的高負擔國家之一，在我國每年新發MDR-PTB 病例數居世界第二[1]。VDR（vitamin D receptor，VDR）基因在染色體12q 上編碼的維生素D 受體，具有多種單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP），有研究稱VDR 基因與結核病的易感性有關[2-3]，但均未對耐藥人群進行分層研究，目前也未發現云南地區漢族人群VDR 基因與MDR-PTB 易感性的報道。本研究選取了目前VDR 基因研究較多的FokI、TaqI 位點作為研究對象，探索云南地區漢族人群VDR 基因單核苷酸多態性與耐多藥肺結核發生的關聯性，并尋找出易感基因的影響因素。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取昆明市第三人民醫院2017 年01 月01 日至2018 年12 月31 日期間就診的云南省漢族MDR-PTB 患者為研究對象，共納入300 例患者作為感染組，門診體檢健康人群300 例作為對照組。其中感染組男性181 例，女性119 例,年齡18～70歲，平均（34.5±4.3）歲；對照組男性165 例，女性135 例，年齡18～70 歲，平均（39.4±2.6）歲，兩組研究對象的性別和年齡差異均無統計學意義（χ2=1.749，P=0.186；t=0.243，P=0.654），具有可比性。

1.2 納入標準

（1）云南省內地區的漢族人群；（2）年齡在18-70 歲之間，性別不限；（3）臨床確診為MDR-PTB 的患者，診斷依據為《中國結核病防治規范實施工作指南（2008 年版）》[4]；（4）胸部影像檢查證實有肺內病變者；（5）入組前4 個月痰培養結果陽性者；（6）自愿加入本研究并簽署知情同意書

1.3 排除標準

（1）肺炎、肺癌和塵肺等患者；（2）非廣泛耐藥結核病患者，排除菌種鑒定為非結核分枝桿菌感染的患者；（3）有嚴重并發癥者；（4）肝功能損害：丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉移酶（AST）水平高于實驗室參考范圍上限的2.5 倍；（5）腎功能損害:血清肌酐水平≥265 μmol/L；（6）心血管疾病、糖尿病患者；（7）妊娠期或哺乳期婦女；（8）HIV、長期使用激素、器官移植等免疫功能低下的患者。

1.4 實驗方法

DNA 的提取及純度測定：所有外周血樣本通過酚/氯仿抽提核酸法提取DNA,試劑盒由北京天根生物工程公司提供。VDR 基因FokI 位點引物為：5'-AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT-3'和 5'-ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC-3'，VDR 基因TaqI 位點引物為：5'-CAGAGCATGGACAGGGAGC-3'和5'-AGGAGAGGCAGCGGTACTG-3'，均由擎科生物（昆明）有限公司合成。FokI的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增體系：反應總體系30 μL，DNA 模板1 μL，上游引物和下游引物各1 μL，PCR Mix 15 μL，ddH2O 12 μL。Fok I 的PCR 擴增條件：預變性94℃5 min、變性94 ℃30 s、退火64 ℃30 s、延伸72 ℃30 s、72 ℃未延伸5 min，共35 個循環。擴增片段長度267 bp。TaqI 的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增體系：反應總體系50 μL，DNA 模板2 μL，上游引物和下游引物各2 μL，PCR Mix 25 μL，ddH2O 19 μL。TaqI的PCR 擴增條件：預變性94℃5 min、變性94℃30 s、退火59℃30 s、延伸72℃30 s、72℃未延伸10 min，共35 個循環。擴增片段長度455 bp。以DL-2000 為標準分子量對照，用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR 產物。純度測定以A260/A280＞1.7 為合格，合格的樣本送擎科生物（昆明）有限公司進行測序。

1.5 基因型的影響因素分析

對感染組進行分層分析，收集感染組患者的性別、年齡（＜60 歲、≥60 歲）、職業（農民、工人、其他）、居住地（農村、城鎮）、文化程度（小學以下、小學～大專、大專以上）、初/復治、耐藥情況（僅耐一線抗結核藥物、耐一線和二線抗結核藥物）、抗結核藥物暴露史（未使用過一線和二線抗結核藥物、僅使用過一線抗結核藥物、使用過一線和二線抗結核藥物）、是否產生過藥物不良反應、是否合并結核性胸膜炎、肺部病灶類型（干酪型、浸潤型）、服藥的依從性作為自變量。依從性參考Morisky 依從性性量化表（MMAS）進行評估是否規律服藥。以基因型（野生型、突變型）作為因變量，對自變量進行單因素分析，篩選出的變量進行二分類logistic 回歸多因素分析。

1.6 統計學處理

數據通過Excel 2016 軟件整理錄入，應用SPSS 20.0 軟件進行統計分析。Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律、兩組間基因型及等位基因頻率分布、單因素分析采用χ2檢驗，多因素分析采用二分類Logistic 回歸分析，檢驗水準ɑ 值取雙側0.05。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗

VDR 基因Fok I 位點FF、Ff、ff 基因型在感染組的數量分別為89，137，74；在對照組中的數量分別為99，160，41；均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗（χ2=2.136，P=0.144；χ2=3.505，P=0.061），樣本均具有代表性。VDR 基因Taq I 位點TT、Tt、tt 基因型在感染組的數量分別為167，109，24；在對照組中的數量分別為185，98，17；均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗（χ2=1.069，P=0.301；χ2=0.696，P=0.404），樣本均具有代表性。

2.2 VDR 基因Fok I、Taq I 位點的基因型和等位基因頻率分布的情況

測序后發現VDR 基因Fok I 位點的多態性均含有FF、Ff、ff 基因型，感染組的分布頻率分別為：29.8%、45.5%、24.7%，對照組的分布頻率分別為：33.0%、53.3%、13.7%。通過χ2檢驗發現3 種基因型分布頻率差異有統計學意義（χ2=11.783，P=0.003）。等位基因F 在感染組中的分布頻率為52.5%，在對照組中的分布頻率為59.7%，等位基因f 在感染組中的分布頻率為47.5%，在對照組中的分布頻率為40.3%，兩組間的分布頻率亦差異有統計學意義（χ2=6.256，P=0.012）。VDR 基因Taq I 位點的多態性均含有TT、Tt、tt 基因型，感染組的分布頻率分別為：55.8%、36.4%、7.8%，對照組的分布頻率分別為：61.7%、32.7%、5.6%。通過χ2檢驗發現3 種基因型分布頻率差異無統計學意義（χ2=2.700，P=0.259）。等位基因T 在感染組中的分布頻率為73.8%，在對照組中的分布頻率為78.0%，等位基因t 在感染組中的分布頻率為26.2%，在對照組中的分布頻率為22.0%，兩組間的分布頻率亦無統計學意義（χ2=2.849，P=0.091），見表1。

2.3 VDR 基因Fok I、Taq I 位點多態性與MDR-PTB 發生的關系

在分析VDR 基因Fok I 位點多態性與耐多藥肺結核發生的關系中發現，ff 基因型的分布頻率具有統計學意義（χ2=8.303，P=0.004），等位基因f 的分布頻率亦具有統計學意義（χ2=6.256，P=0.012）。此數據表明VDR 基因Fok I 位點多態性與MDR-PTB 易感性有關，其中基因型ff 增加了MDR-PTB 的易感性（OR:2.008，95% CI:1.246，3.235），等位基因f 亦增加了其的易感性（OR:1.388，95%CI:1.065，1.682）。而在VDR 基因Taq I 位點多態性與耐多藥肺結核發生的關系中，突變基因型和等位基因的分布頻率均無統計學意義（P＞0.05），此數據表明VDR 基因Taq I 位點多態性與MDR-PTB 易感性無關，見表2。

表1 VDR 基因Fok I、Taq I 位點的基因型和等位基因頻率分布［n（%）］Tab.1 Genotype and allele frequency distribution of Fok I and Taq I loci in VDR gene［n（%）］

表2 VDR 基因Fok I、Taq I 位點多態性與MDR-PTB 的關系［n（%）］Tab.2 Relationship between the polymorphism of VDR gene Fok I and Taq I and MDR-PTB［n（%）］

2.4 基因型的影響因素分析

由表2 數據得知，VDR 基因Fok I 位點ff 基因型可增加MDR-PTB 的易感性，為求尋找影響基因型的非遺傳因素，以感染組中野生型（FF）和突變型（Ff、ff）基因作為因變量進行分層回歸分析。結果顯示，患者的依從性（χ2=6.875，P=0.009）、藥物的不良反應（χ2=4.278，P=0.039）、合并結核性胸膜炎（χ2=8.479，P=0.004）差異具有統計學意義；而患者的性別、年齡、職業、居住地、文化程度、初/復治、耐藥情況、抗結核藥物暴露史、肺部病灶類型的差異均無統計學意義（P＞0.05），見表3。

將單因素分析中的所有因素作為自變量，基因型作為因變量進行二分類Logistic 回歸分析。結果顯示，患者的依從性、藥物的不良反應、合并結核性胸膜炎是突變基因型的獨立影響因素，其中患者的依從性是突變基因型的保護因素（OR=2.583，95%CI=1.342～4.287），藥物的不良反應（OR=0.162，95%CI=0.094～0.432）、合并結核性胸膜炎（OR=0.249，95%CI=0.026～0.278）是突變基因型的危險因素，見表4。

3 討論

在感染性疾病中，遺傳因素與非遺傳因素均能影響病原體對宿主的表達，結核分枝桿菌也不例外。本研究通過探索云南地區漢族人群VDR 基因多態性與MDR-PTB 的關系中發現，VDR 基因FokI 位點的ff 基因型是MDR-PTB 的易感基因。同時對感染組進一步分析發現，VDR 基因FokI 位點突變可能對患者的服藥依從性、是否合并結核性胸膜炎以及藥物的不良反應有一定的影響。

在1988 年VDR 基因被首次克隆成功，其包含8 個內含子和9 個外顯子，可編碼427 個氨基酸，在染色體12q 上編碼的維生素D 受體（VDR），是維生素D 主要代謝產物1,25-(OH)2-D3 的關鍵作用受體，VDR 的多態性位點FokI 位于第2 個外顯子的起始密碼上，有研究證明，當該位點發生突變時，VDR 將從第2 個密碼子開始翻譯，從而導致翻譯出的氨基酸僅有424 個，比正常VDR 編碼的蛋白質少了3 個氨基酸[5]。VDR 基因的Taq I 位點位于第9 個外顯子上，其多態性是由第352 個異亮氨酸密碼子突變造成的[6]。巨噬細胞是抵御結核分枝桿菌的主要效應細胞，當機體細胞啟動免疫應答時，巨噬細胞對結核分枝桿菌具有吞噬作用[7]。維生素D 可以促進巨噬細胞的生成，當結核分枝桿菌侵襲機體時，巨噬細胞可以啟動免疫應答，并分泌大量的細胞因子，進而刺激T 淋巴細胞分泌IFN-γ，同時維生素D 亦可以抑制抗原呈遞細胞過度刺激T 淋巴細胞，從而避免分泌過多的TNF-α 引起免疫損傷[8]。

表3 感染組中基因突變的單因素分析［n（%）］Tab.3 Single factor analysis of gene mutation in the infected group［n（%）］

表4 感染組中基因突變的Logistic 多因素分析Tab.4 Logistic multivariate analysis of gene mutation in the infected group

VDR 基因功能缺失與多種疾病的發生有關，比如：乳腺癌、糖尿病、銀屑病、骨質疏松、多發性硬化、類風濕性關節炎、惡性黑色素瘤等[1]。機體內維生素D 的缺乏也可以使結核病的發病率增加[9]，金武等[10]的研究發現，擁有FF 基因型和Ff基因型的患者體內維生素D 的含量明顯高于ff 基因型，ff 基因型的患者體內維生素D 合成不足，更加易感結核。在細胞核上維生素D 受體的表達數量和空間構象，以及與維生素D 形成復合物的能力均能影響其生物學性能[7，11]。在全球范圍內，VDR 基因多態性與結核病的易感性不盡相同，說明VDR 基因多態性存在地域差異。有研究發現，VDR 基因FokI 位點中ff 基因型可降低維生素D 受體與維生素D 形成復合體并且對抗結核分枝桿菌的作用，ff 基因型是結核病的易感基因[12-13]，另一項研究表明，結核患者ff 基因型的分布頻率顯著性高于健康人群[14]，這些結論與本研究結果一致。國內也有較多的類似研究，一項關于初治肺結核的漢族人群研究顯示，VDR 基因的雜合型Ff 基因型與結核病的發熱癥狀有關，發熱是活動性肺結核的主要癥狀之一，提示Ff 基因型是活動性肺結核的保護因素[15]。雖然在本研究中，Ff 基因型感染組的分布頻率為45.5%，低于對照組的53.3%，亦是耐多藥肺結核的保護因素，但不具有統計學意義（P=0.794），說明活動性肺結核與耐多藥肺結核的基因多態性可能具有一定區別。一項關于河南省結核患者的易感性分析顯示，VDR 基因的FF基因型是結核發病的保護因素（OR=0.72,CI:0.55～0.93），說明等位基因F 的突變，能增加結核病的易感性[16]。在兩項關于少數民族的研究中顯示，新疆維吾爾族人群的VDR 基因多態性與結核病的易感性無關，而在新疆哈薩克族人群的研究中顯示，Fok I 位點的等位基因f 與結核病的易感性有關[17-18]，國內一項Meta 分析結果顯示，VDR 基因的Fok I 位點的ff 基因型是結核病的易感基因[19]。這些結論與本研究結果相同。但在另一項研究中發現，VDR 基因的FokI 位點與機體的維生素D 含量沒有相關性，也不會增加結核病的易感性[20]。在伊朗的結核患者中的研究顯示，VDR 基因的Fok I位點與易感性無關[21]。國外一項Meta 分析結果顯示，VDR 基因的Fok I 位點與結核病的易感性無關[22]。這些可能與地域關系有關，也可能與國內外的診斷標準及治療方案不盡相同有關。

VDR 基因的Taq I 位點中，T 等位基因通常被認為是結核病的易感基因，t 等位基因被認為是保護基因[18]，在結核患者中的t 等位基因往往非常稀少，但在本研究中，感染組和對照組的t 等位基因分布頻率分別為26.2%和22.0%，顯示感染組的t等位基因并未顯著下降，這可能與MDR-PTB 患者在后期治療中的免疫重建有關。在印度人群中的研究顯示，VDR 基因的Taq I 位點多態性與女性結核病患者的易感性有關[23]。一項關于東亞與西亞人群的Meta 分析顯示，VDR 基因的Taq I 位點與結核病的易感性也有關[24]。但在我國藏族人群的VDR 基因研究中，Taq I 位點多態性與結核病的易感性無關[25]，非洲人群的研究也顯示，VDR 基因的Taq I 位點與結核病的易感性無關[26]。在我國江蘇省人群的一項研究顯示，VDR 基因的Taq I 位點亦與結核病的易感性呈弱相關[27]。Lee 等[28]進行的Meta 研究也顯示，VDR 基因的Taq I 位點與結核病的易感性無關，這些結論與本研究結果一致。目前存在這樣的差異，可能與民族、地域以及非遺傳因素有關。

為求進一步研究VDR 基因FokI 位點ff 基因型對MDR-PTB 的影響，本研究選取了多個非遺傳因素進行logistic 回歸分析。結果顯示，VDR 基因FokI 位點突變可能對患者的依從性、藥物的不良反應與合并結核性胸膜炎有一定的影響，這3 個因素與一項耐多藥肺結核的影響因素分析結果相同[29]，也間接反映了基因型ff 與MDR-PTB 的關系。在依從性方面，由于MDR-PTB 的療程較長，患者的經濟與心理壓力較大，容易造成不規律服藥的情況發生。在本研究中發現，基因突變型患者未規律服藥的比例為68.2%，顯著高于基因野生型患者的比例51.7%，說明FokI 位點的突變的患者更容易發生未規律服藥的情況，亦更容易引起耐藥的發生。長期治療和疾病本身帶來的痛苦會使患者長期處于慢性消耗狀態，會降低MDR-PTB患者的生存質量[30]。通過提高患者的依從性，可提高患者的生存質量，也能減少耐藥情況的發生。有研究顯示[31]，社會家庭的支持對MDR-PTB 患者的依從性有一定的幫助。家庭的陪伴、臨床護理途徑、格林護理模式等也有助于提高治療的依從性[32]。在不良反應方面，患者通常會因為難以耐受藥物的不良反應而自行中斷治療，從而降低治療依從性。多項研究顯示[33-34]，藥物不良反應的發生會影響患者治療的依從性。在本研究中基因突變型的不良反應發生率為46.9%，顯著高于基因野生型的發生率33.7%，也高于包昌琳等[29]的報道（38.6%）。說明FokI 位點突變的患者可能更容易發生藥物不良反應。但在李鳳麗等[35]的研究中發現，藥物不良反應的發生未對患者的依從性產生影響，這可能與醫務人員進行過集中培訓有關，對患者進行跟蹤督導，使患者了解診療過程中可能發生的藥物不良反應類型及應對措施，培訓患者疑似即報，及時就醫。這些措施可以降低藥物不良反應的發生，從而提高依從性。在合并癥方面，本研究選擇了常見的合并癥結核性胸膜炎作為觀察對象，其中基因突變型患者合并結核性胸膜炎的發生率為79.6%，野生型患者合并結核性胸膜炎的發生率為62.9%，說明FokI 位點突變的患者可能更容易發生結核性胸膜炎。Soborg C 等[26]的研究報道顯示，肺結核合并結核性胸膜炎的發生率為35.2%，在合并癥類型中排名第一。本研究發生率較高的原因可能是選擇的樣本均為MDR-PTB 患者，并且病情較重，易并發結核性胸膜炎，而且結核性胸膜炎不易獲得組織標本，病檢率較低，也是其發生率高的原因之一。臨床應當加強組織標本的收集和耐藥監測，在治療過程中，應當充分考慮合并癥的情況，在治療的序貫、藥品的選擇和交叉感染等方面應當充分權衡[36]。

結核病是由多種基因之間的協同作用，或者是不同基因與環境之間的相互作用所導致[37]。在不同地域中開展結核病遺傳基因的流行病學調查，有助于揭示基因組學在結核病發病中的作用，闡明結核病的發病及耐藥機制，目前VDR 基因對結核病易感性的致病機制尚不清楚，仍需更多的不同地區與不同民族的大樣本分析結果，為致病機制研究提供理論基礎，為結核病的防控貢獻力量。