COVID-19 患者糞便核酸檢測結果特征及其臨床意義

馬志強，王 霖，羅 煜，瞿春燕，李保萍，馬云珊，董 睿，吳艷蓉，趙金花，許婭琳

（1）昆明市第三人民醫院檢驗科；2）關懷科，云南昆明 650301）

2019 年12 月，湖北省武漢市部分醫院及醫療機構陸續報道新型冠狀病毒感染的肺炎病例[1-2]，隨著新增病例的大量增加，疫情迅速在中國各地蔓延開來并波及全球20 多個國家和地區[3-5]。經研究，其基因特征與SARSr-CoV 和MERSr-CoV 有明顯區別，但與蝙蝠 SARS 樣冠狀病毒（bat-SL-CoVZC45）同源性達85%以上[6-7]。新型冠狀病毒由單一的核糖核酸（RNA）構成，屬于β屬的新型冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形。新冠肺炎的傳播途徑以經呼吸道飛沫和接觸傳播為主，同時有證據顯示COVID-19 亦可通過氣溶膠和消化道傳播，且有人群普遍易感的特點。臨床表現為發熱、乏力、干咳等，少數患者伴有鼻塞、流涕、腹瀉等癥狀，但也可隱匿發病[8]。新冠肺炎確診主要通過實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（revers etranscriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR）和病毒基因測序。RT-PCR 特異性強、靈敏度高、快速經濟以及應用簡便，在COVID-19患者的診治評估中具有重要意義。《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第五版）》將COVID-19 感染核酸確診檢測的生物標本定為呼吸道標本[9]。因此核酸檢測標本主要集中在咽拭子和痰等標本上，但是對COVID-19 患者其他類型標本如糞便的核酸檢測結果缺少相關的報道，據此本研究旨在利用RT-PCR 的方法檢測新冠肺炎患者糞便標本的帶毒情況，初步闡明COVID-19 感染后在患者體內的分布特點及其臨床意義，為新冠肺炎的診斷和分析傳播途徑提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究收集昆明市第三人民醫院自2020 年1月30 日至2020 年3 月10 日收治的COVID-19 確診病例的糞便標本用于核酸檢測，昆明市第三人民醫院為云南省COVID-19 定點收治醫院，也是云南省衛健委第一批確認開展COVID-19 核酸檢測的實驗室，在此期間共收治了39 例確診病例，所有生物標本均嚴格按標準流程密封轉運至本院檢驗科核酸檢測實驗室。COVID-19 診斷標準：根據《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第七版）》[10]，符合相關臨床表現，及糞便COVID-19 核酸檢測陽性[7-9]。本研究所有病例的個人信息均保密，所有生物標本僅用于科學研究和疫情防控。

本研究共納入COVID-19 確診病例糞便標本25 例用于核酸檢測，其中男12 例，女13 例，平均年齡（49.5±17.3）歲。

1.2 儀器和試劑

主要儀器：NP968-C 全自動核酸提取儀（西安天隆科技有限公司），TL988-IV 實時熒光定量PCR 儀（西安天隆科技有限公司），CFX 96 實時熒光定量PCR 儀（美國伯樂科技公司）。相關試劑：COVID-19 病毒核酸提取試劑盒（EX-DNA/RNA病毒），新冠狀病毒（2019-nCoV）ORF1ab/N 基因核酸檢測試劑盒（天隆）、2019 新型冠狀病毒（ORF1ab/N 基因）核酸檢測試劑盒（上海伯杰）。

1.3 引物和熒光探針

引物與熒光探針有2 個靶序列，FAM 區域靶標（ORF1ab 基因）。

正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA；反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA；熒光探針（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'。HEX 區域靶標（N 基因）；正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT；反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG；熒光探針（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'。

1.4 標本處理與檢測

標本處理 所有糞便標本先經過56℃30 min 滅活后，取黃豆大小的大便（1g 左右）于1.5 mL EP管中，加入1 mL 生理鹽水振蕩混勻10 s，3 000 r/min 離心30 s；取200 μL 上清液置于新的EP 管中，12 000 r/min 離心5 min，棄上清液，加入1 mL 生理鹽水混勻，12 000 r/min 離心10 min，取下層沉淀50 μL 加入核酸提取試劑盒提取病毒核酸。

標本檢測 依次加入30 μL 預先配制好的PCR混合液和20 μL 上述處理后的標本至PCR 反應管，在實時熒光PCR 儀上機進行擴增檢測，結束后判讀結果。

1.5 結果判讀

先觀察內標在對應的通道是否有擴增曲線，且擴增產物的熒光信號需達到設定的熒光閾值所對應的擴增循環數（cycle threshold，Ct）≤40。以天隆檢測試劑為例，陽性：ORF1ab 和N 基因檢測呈典型的S 型擴增曲線，且Ct 值≤37；陰性：無Ct值，內標通道檢測結果為陽性。

1.6 統計學處理

采用SPSS 對數據進行分析，計數資料用率（%）表示；計量資料滿足正態分布時，采用配對t檢驗。檢驗水準取α=0.05，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同治療階段糞便ORF1ab/N 基因檢測

對COVID-19 確診病例的糞便標本分別進行病毒ORF1ab/N 基因核酸檢測。結果顯示，治療中期患者ORF1ab/N基因核酸檢測擴增曲線呈S型，治療后期患者ORF1ab/N基因檢測未得到擴增曲線，見圖1。

2.2 不同治療階段患者糞便核酸檢測結果

不同治療階段的確診病例陽性數為：治療中期12 例，治療后期3 例，陽性率分別為48%、12%，見表1。

圖1 不同治療階段糞便ORF1ab/N 基因擴增曲線Fig.1 Amplification curve of ORF1ab/N gene in stool at different treatment stages

表1 不同治療階段糞便核酸檢測結果［n（%）］Tab.1 The stool nucleic acid test results at different treatment stages［n（%）］

2.3 不同治療階段患者糞便核酸檢測CT 值結果變化

根據1.4 結果判讀作依據分析CT 值，隨著病程和治療時間的推進，患者糞便核酸陽性檢出例數有明顯的減少，同時CT 值總體有升高的趨勢。結果表明，經過抗病毒治療后，患者病毒載量有所降低，抗病毒治療效果差異有統計學意義（P＜0.05），見表2、圖2。

表2 不同治療階段糞便核酸檢測CT 值結果比較（±s）Tab.2 Comparison of CT results of stool nucleic acid tests in different treatment stages（±s）

與治療中期比較，△P＜0.05。

圖2 不同治療階段糞便核酸檢測CT 值的變化Fig.2 The Changes of CT values in stool RT-PCR at different treatment stages

3 討論

新冠肺炎疫情在中國已進入最關鍵的時期，最初有關COVID-19 的報道認為其與早年發生的SARS 冠狀病毒存在許多相似之處，多數感染者表現為發熱、乏力、呼吸困難等，少數患者以呼吸道癥狀發病如：流涕、打噴嚏、咽部腫痛等[1，11-13]。在臨床診療中，僅依靠臨床表現或實驗室常規檢查均不能作為新冠肺炎的準確依據，確診的金標準是檢出COVID-19 病毒核酸。因此，及時準確的病毒核酸檢測不僅在早發現、早隔離、早治療方面發揮至關重要的作用，而且可以為與密切接觸、大量觀察者的篩查節省寶貴的醫療資源[13]。

對于COVID-19 的實驗室檢測，筆者依據新型冠狀病毒實驗室檢測技術指南發布的COVID-19 熒光PCR 檢測引物和探針對25 例COVID-19 確診病例的糞便標本進行病毒ORF1ab 基因及N 基因核酸檢測。結果表明，在確診的25 例糞便標本中，根據發熱入院時間和治療時間來劃分，治療中期糞便標本的病毒核酸檢測有12 例為陽性，確診病例中糞便標本COVID-19 核酸陽性檢出率高達48%。其中男女比例為1:1.08，性別比例在統計學上無明顯差異，因此沒有證據證明性別易感性。經過治療后，患者糞便病毒核酸檢測僅有3 例為陽性，同時相應的檢測CT 值總體上升，間接反映出病毒載量呈降低的趨勢，這說明常規抗病毒治療效果值得肯定。本研究顯示糞便標本COVID-19 核酸檢測呈陽性，但是有些呼吸道標本核酸檢測卻為陰性，這提示筆者在呼吸道標本的采集方法和類型的問題上應當引起足夠的重視。糞便標本取材方便，不像呼吸道標本對取樣要求較高，并且糞便標本的質和量更容易得到控制。同時在疾病的早期或癥狀較輕者，呼吸道標本可能病毒載量較低，這可造成核酸檢測假陰性結果，而研究表明多數經呼吸道感染的病毒后期有糞便排毒的特點[14]，因此選擇糞便標本進行核酸檢測可防止漏檢，對COVID-19 核酸檢測具有重要的意義。

綜上所述，研究新型冠狀病毒糞便標本中的病毒含量及持續時間，是實驗室診斷COVID-19 感染及評價治療效果的重要方法之一。本研究結果對COVID-19 實驗室檢測標本的選擇具有一定的參考價值，在后續的研究中可結合其他類型的標本做出系統的檢測和治療方案。