沉默囊泡分選蛋白(VPS)對辣椒疫霉效應因子RxLR504 功能的影響

朱彤彤，馬艷飛，江韋霖，楊 磊，李念袁，董一帆，辛 琪，張修國*，孫文秀*

1.長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434000

2.山東農業大學植物保護學院，山東 泰安 271018

大多數的疫霉屬卵菌是重要的植物病原菌，可以侵染辣椒、番茄、馬鈴薯等在內的多種經濟型作物，嚴重危害全球的農業生產，并影響整個生態系統。如1846 年致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的愛爾蘭饑荒，橡樹疫霉（P.ramorum）造成的美國及加拿大的橡樹猝死，大豆疫霉（P.sojae）引起的大豆根莖腐病，給農業造成了巨大經濟損失[1]。在植物與病原菌的長期協同進化過程中，病原菌通過分泌效應蛋白進入寄主細胞的不同部位，干擾寄主細胞正常的代謝過程，破壞寄主的防衛反應，營造出一個適于自身繁殖的小生境[2，3]。效應蛋白主要分為質外體效應蛋白及胞質效應分子，胞質效應分子包括RxLR 效應分子及CRN 效應分子，在病原菌定殖過程中起著重要作用[4，5]。

在真核生物中，蛋白質的跨膜運輸以及跨區室運輸是通過囊泡的定向運輸完成，囊泡運輸是通過細胞質膜上的物質與運輸相關分子共同作用，形成囊泡定向與胞內運輸小泡融合運輸至靶膜和靶細胞器上[6]。參與此過程的效應分子中，Rab GTPase 起著重要作用，通過囊泡運輸調節運輸特異性、細胞器間的物質交換和信息傳遞[7]。VPS 蛋白即為Rab 蛋白家族一員。近年來，越來越多的研究報道Rab 可能參與了生長素與植物發育、信號轉導、自噬與細胞程序性死亡、細胞骨架形成等多個生物學過程。Friml 對PIN 類生長素輸出蛋白定位和運輸的研究有助于對生長素分布與植物發育關系進行描述[8]。磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）被報道可以通過與Rab 蛋白的相互作用調節膜運輸[9，10]。抗凋亡蛋白Bcl-2 聯系細胞凋亡和自我吞噬之間的調節，通過與Beclin 1 連接抑制依賴于Beclin 1 的自噬作用，同時Beclin 1 隔斷與VPS34 的聯系[11]。然而目前還沒有對Rab 參與抗病具體機制和互作蛋白的報道。

病毒誘導的基因沉默（Virus-induced gene silencing，VIGS）屬于轉錄后沉默（Post-transcriptional Gene Silencing，PTGS）[12]。其作用原理是帶有目的基因的載體侵染植物后，在植物體內進行復制及表達時形成雙鏈RNA（Double stranded RNA，ds RNA），在反轉錄時dsRNA 被特異性的內切酶切割成小分子RNA（Small interfering RNA，siR NA），而后siRNA 在植物體內與蛋白質結合為RNA 沉默復合體（RNA-induced Silencing Complex，RISC），RISC 與細胞內RNA 互作從而產生沉默現象[13]。煙草脆裂病毒是廣泛應用于植物中的一種雙向瞬時表達載體，分別使用兩種不同的根瘤農桿菌（TRV1、TRV2）共同作用于植物體實現基因沉默[14]。與普通常規的轉基因技術相比，VIGS 技術可明顯縮短試驗時間，一般在2～3 周就會出現明顯效果。VIGS 技術既可適用于單子葉植物也可適用于雙子葉植物，目前在番茄、馬鈴薯、豆類植物中都有應用[15-17]。VIGS 技術具有簡便、高效、高通量的優勢，近年來在基因功能研究中應用較為廣泛[18]。

前期證明通過酵母雙雜，免疫共沉淀及雙分子熒光實驗證明證明辣椒疫霉效應分子RxLR504 與囊泡分選蛋白(VPS)相互作用。本實驗以VPS 為沉默對象，實驗室本氏煙為供試材料，進而在囊泡分選蛋白VPS 表達缺陷植株上驗證RxLR504 抑制INF1 引起的壞死能力是否喪失。研究結果為探索RxLR504 在辣椒疫霉致病機理中的功能提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙草為本實驗室保存的本氏煙Nicotiana benthamiana，種植于25 ℃恒溫溫室，濕度70%，光照16 h、黑暗8 h 交換更替。

Trans5α、GV3101 購自北京全式金生物技術有限公司，限制性內切酶BamHI、SmaI 購自賽默飛生物公司。煙草瞬時沉默載體pTRV1、pTRV2 及沉默對照TRV::PDS 載體由清華大學劉玉樂老師饋贈。辣椒疫霉標準菌株LT1534 以及含RxLR504 效應分子、Avr3a、INF1 及GFP 農桿菌菌株均保存于山東農業大學植物保護學院真菌資源與利用研究室。

1.2 NbVPS 基因克隆及沉默載體構建

通過本氏煙基因組網站https://solgenomics.net/tools/blast/比對NbVPS 基因序列，以本氏煙cDNA為模板，克隆基因。通過https://vigs.solgenomics.net/工具設計沉默片段，利用BamHI、SmaI 限制性內切酶將沉默片段構建至pTRV2 病毒載體，轉化大腸桿菌DH5α，測序驗證。測序正確后，提取質粒轉化至植物表達菌株GV3101，命名為TRV::NbVPS。

1.3 本氏煙的沉默實驗

挑取含TRV1、TRV::PDS、TRV::GFP 及TRV::NbVPS 農桿菌單菌落，接種至添加利福平及卡那霉素的LB 液體培養基中，放置于28 ℃恒溫搖床，220 r/min，震蕩過夜培養。4000 rpm 離心5 min收集菌體，充分倒盡上清后，加入10 mM MgCl2洗滌菌體3 次；加入適量的10 mM MgCl2(含10 mM MES，200μM As)緩沖液懸浮菌體，使懸浮液OD600值達到1.0。靜置2 h 以上后，分別將TRV::NbVPS、TRV::PDS、TRV::GFP 菌懸液與TRV1 菌懸液等體積混合，取3-4 葉期本氏煙植株，將菌懸液接種于下部分最大兩片煙葉，并在相同條件下培養2～3 周，進行下步試驗。

1.4 沉默效率驗證

待接種TRV::PDS 對照植株頂端葉片出現白化現象時，收取接種TRV::NbVPS 實驗組及TRV::GFP對照組植株頂端葉片，采用OMEGA 植物RNA 提取試劑盒進行本氏煙RNA 提取，實驗步驟參照試劑盒說明書。以RNA 為模板，參照諾唯贊反轉錄試劑盒說明書，在冰上進行反轉錄實驗，構建cDNA庫。運用Primier Quest Tool(http://sg.idtdna.com/Primer Quest/Home/Index)軟設計NbVPS 特異性引物。以本氏煙持家基因actin 作為內源參照，接種TRV::GFP 植株中VPS 基因表達量作為對照，驗證TRV::NbVPS 植株中靶標基因表達水平。采用諾唯贊熒光定量試劑盒進行qRT-PCR 檢測，檢測步驟參照試劑盒說明書進行。相比于對照，實驗組靶標基因表達量為正常表達水平30%以下即為沉默成功，證明該植株可作為供試植株作為下步實驗。

1.5 沉默后效應因子功能檢測

按上述方法制備含RxLR504、GFP、INF1 農桿菌菌懸液，調整OD600值為0.5 左右，靜置2 h以上。以注射GFP 及Buffer 為對照，在本氏煙草葉片接種RxLR504，24 h 后在相同部位接種INF1菌懸液。一周后，觀察接種葉片癥狀，拍照記錄結果。

2 結果與分析

2.1 沉默片段設計

在VIGS Tools 網站中置入目的靶標基因序列，設計特異性沉默片段，如圖1 所示，沉默片段長度為300 bp，位于609-908 位閱讀框，靶標區域檢測分數為81，質量較好。

圖1 VIGS Tool 沉默片段設計Fig.1 Design of silence fragment by VIGS Tool

隨后，成功以特異性引物從本氏煙基因組文庫中克隆靶標片段，并構建至病毒沉默載體pTRV2，獲得重組載體TRV::NbVPS。將重組載體轉化至GV3101 農桿菌表達菌株，用于下步實驗。

2.2 樣品RNA 提取及檢測

將制備好混有TRV1 輔助載體的TRV::NbVPS、TRV::GFP、TRV::PDS 農桿菌菌懸液分別注射煙草，待TRV::PDS 處理的葉片呈現明顯白化現象時，其他處理的煙草葉部生長狀況與野生型煙草無明顯區別。提取對照組及實驗組RNA，分光光度計檢測顯示，樣品OD260/OD280值均在1.8～2.0 之間，說明所提取的總RNA 純度較高，OD260/OD230值均在2.0 左右，說明RNA 樣品鹽離子污染低。經瓊脂糖凝膠電泳檢測，樣品的28S 及18S 條帶明亮、清晰、條帶銳利，且28S 條帶亮度在18S 條帶的兩倍以上，RNA 質量好，結果可靠（圖2）。

圖2 本氏煙總RNA 凝膠電泳檢測Fig.2 Gel detection of the N.benthamiana total RNA

2.3 沉默效率驗證

利用南京諾唯贊生物公司反轉錄試劑盒，以RNA 為模板構建cDNA 文庫。qRT-PCR 檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物公司，NbVPS 在本氏煙中表達量是相對于內源持家基因NbActin 而定。

圖3 靶標基因沉默效率檢測Fig.3 Silence detection of the target gene

結果顯示（圖3）：TRV::NbVPS 處理植株葉片中，NbVPS 基因表達量明顯下調，與TRV::GFP相比顯著下降86.2%。表明農桿菌接種處理2～3 周后，VIGS 沉默體系引起靶標基因NbVPS 的特異性下調表達，植株可用于后續研究。

2.4 沉默植株上RxLR504 功能檢測

以接種Avr3a、GFP 及Buffer 作為對照，在沉默NbVPS 本氏煙上瞬時表達RxLR504，24 h 后在相同注射部位接種死亡激發子INF1，同時以TRV::GFP 沉默植株作為對照。接種一周后，觀察實驗結果并拍照記錄。

圖4 沉默植株上RxLR504 功能檢測Fig.4 Function detection of RxLR504 in silenced lines

結果如圖4 所示，在TRV::GFP 對照沉默植株及TRV::NbVPS 靶標基因沉默植株中，陽性對照Avr3a 仍強烈抑制INF1 引發的細胞死亡。陰性對照GFP 及Buffer 皆不能抑制INF1 引發的細胞死亡，葉片壞死。注射效應因子RxLR504 部位與注射陽性對照Avr3a 部位癥狀相同，說明RxLR504 在本氏煙上抑制INF1 引發細胞死亡能力不變。

3 討論

Rab 蛋白是小GTPase 蛋白家族中數量最為龐大的成員，幾乎參與所有細胞內的跨膜運輸，Rab蛋白功能的正常行使在生物體內起著重要作用。液泡分選蛋白（Vacuolar sorting protein，VPS）VPS是Rab 蛋白家族的重要構成成分。目前，有關VPS 功能的研究主要集中細胞凋亡、植物自噬和生長素運輸等生物學過程[19]，尚未見植物抗病過程中相關報道。因此對植物中VPS 的功能分析及與辣椒疫霉效應分子RxLR504 的相互作用研究，為進一步探索植物與病原物的互作機理及更好地設計生物農藥提供理論依據。

植物在與病菌的長期斗爭中，形成了一套對付病菌有效的免疫功能。對卵菌無毒基因的克隆和研究對于了解病原菌致病性和寄主植物的專化抗性具有重要意義。INF1 是致病疫霉（P.infestans）的elicitin，能夠誘導本氏煙細胞產生HR 反應，防衛反應過程中產生生理生化的改變。因此INF1 可以用來誘導產生PAMP 觸發的PCD（PT-PCD），RxLR504 作為卵菌的效應分子，不會跨物種與INF1互作而影響其功能，其作用位點應該是植物的防衛反應信號通路或下游基因的表達。因此，鑒定效應分子抑制PTI 通路中的作用靶標及調控因子對理解病原物致病機制和植物抗病機理具有重要意義。

本研究利用VIGS 沉默煙草液泡分選蛋白VPS，經沉默處理后，VPS 基因表達量在TRV::NbVPS煙草中與TRV::GFP 對照煙草相比顯著下降，說明VIGS 沉默體系的可靠性。進一步開展在煙草葉片上瞬時過表達實驗發現，辣椒疫霉效應分子RxLR504 仍然能夠在VPS 表達缺陷植株上抑制INF1 引發的壞死，證實VPS 不參與植物免疫的PTI 通路。效應分子功能的復雜性說明其可能作用與植物防衛通路的各個組成部分，它們通過共同協作使病原菌發揮出最大毒力，充分抑制寄主的防衛反應，控制病原菌對寄主的侵染過程。RxLR504 抑制INF1 引發的細胞死亡的PTI 通路涉及的靶標蛋白及調控途徑還有待今后進一步研究。