氰氨化鈣對植煙土壤微生物多樣性的影響

劉晨祥，戴林建

湖南農業大學農學院，湖南 長沙 410128

優質煙葉的生產離不開優質土壤[1]。土壤微生物是土壤有機質和養分轉化、循環的動力，并參與土壤中能量和養分循環等過程[2-4]。土壤微生物對土壤肥力有著至關重要的影響[5]。長期連作導致土壤肥力下降，病蟲害增多，嚴重影響了烤煙生產的可持續發展[6]。土壤微生物中最常見的類群是細菌，細菌多樣性對于土壤生態過程有著重要的影響[7，8]。因此，土壤細菌的群落結構可以很好的反映土壤的肥力狀況[9]。施肥可以顯著改善土壤肥力，利用有機肥料培肥土壤、參與農業生產可持續發展是中國農業的特色之一[10]。氰氨化鈣是一種高效環保型生態藥肥，具有提供養分和消除病菌的雙重效果，施用后不會增加土壤鹽分，對土壤環境無污染[11-14]。本試驗以氰氨化鈣、生物炭、餅肥等為試驗材料，研究不同物料配施方式下煙田土壤微生物群落結構的變化特征，明確改善煙田土壤微環境的有效配置方式與施肥技術，為指導煙農合理施肥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2019 年3 月下～8 月中旬在湖南省瀏陽市永安鎮豐裕村進行，北緯N28°16′8.47″，東經E113°20′21.90″。日照時數約為1600 h/a，平均氣溫17.5 ℃/a，無霜期270 d，降水量約均勻一致。供試土壤為煙稻輪作紅壤土。基本農化性狀：含有機質26.6 g/kg、堿解氮82.34 mg/kg、速效鉀119.53 mg/kg、速效磷41.7 mg/kg、pH5.49。烤煙專用復合肥(N:P2O5:K2O=1551 mm，降雨期約為158 d，日照時數約為1595 h/a，屬于亞熱帶季風氣候。土壤肥力8:12:25)，氰氨化鈣購于上海阿茲肯化工有限公司（總氮≥19.8%，鈣≥35%），稻殼生物炭（有機質≥45%，氮磷鉀≥5%，總碳≥20%），生物發酵菜籽餅肥由當地煙農提供（N+P2O5+K2O≥8%）。以烤煙HN2146 為供試品種。

1.2 試驗設計

試驗處理包括：T1 為150 kg/km2氰氨化鈣施用量；T2 為施用150 kg/km2氰氨化鈣+600 kg/km2生物炭；T3 為施用150 kg/km2氰氨化鈣+600 kg/km2餅肥；T4 為施用150 kg/km2氰氨化鈣+600 kg/km2生物炭+600 kg/km2餅肥；CK：當地煙葉栽培施肥方案。試驗共設5 個處理，不設計重復，每個處理面積為180 m2，隨機排列。各物料按照試驗設計用量，施用時與基肥充分混合條施于壟間，其他煙田管理按當地煙葉生產技術方案進行。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 取樣方法 于烤煙移栽100 d 后采集土壤樣品，每個處理大區隨機選定3 個點，每個點選取5株煙，并按距煙株7 cm 為半徑的圓周處取根際土樣，各點5 株煙所取根際土壤混合前，隨機2 個點單獨裝入無菌密封袋中，立即放入冰盒中保存。帶回實驗室后放入在-80 ℃冰箱保存，一共15 個樣用于土壤高通量測定微生物種群結構和多樣性。

1.3.2 測定方法 土壤高通量測序在北京諾禾致源科技有限公司的Ion S5TMXL 測序平臺進行。

1.4 數據分析

高通量測序分析在Novomagic 云平臺（magic.novogene.com）進行。其他數據分析用SPSS 22.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理及不同時期植煙根際土壤細菌功能多樣性分析

表1 是不同處理土壤樣本的Alpha 多樣性指數，不同處理樣本的Coverage 指數都在98%以上，可以比較準確地反映不同處理樣本的真實情況。各處理Ace 指數和Chao1 指數均低于CK，且以T2處理（氰氨化鈣+生物炭混施)最低，表明T2 處理土壤樣本的細菌種類最少，這可能是因為生物炭的施入提高了土壤的通透性，改變了土壤中厭氧菌的生存環境，不利于厭氧菌的生存，從而導致多樣性指數降低。而同樣施用了生物炭的處理T4，其Ace 指數和Chao1 指數均低于T1 與T3 而高于T2，這可能是因為隨著餅肥的施入，為微生物提供了大量營養物質，促進了微生物的活動，進而導致多樣性指數升高。各個樣本的平均Shannon 指數大于7，說明植煙根際土壤細菌群落多樣性水平較高。

表1 不同處理土壤細菌Alpha 多樣性Table 1 Different treatments for soil bacterial Alpha diversity

2.2 不同處理植煙根際土壤細菌群落結構分析

在門水平上，5 個處理的土壤樣本主要分屬49 個門，126 目，229 科。對各處理相對豐度前十的菌門進行統計，約占總菌門數量的78.37%至79.94%。各處理土壤中的第一大類群細菌為變形菌門(Proteobacteria)，在各土壤樣品中均占細菌數量的30%以上。第二大類群為酸桿菌門(Acidobacteria)，在各土壤樣品中占細菌數量的比例在10%以上。第三大類群為綠彎菌門(Chloroflexi)，也占細菌數量的10%左右。這3 類菌占到了土壤細菌的一半以上。

在屬水平上對各土壤樣本進行分析發現，5 個處理土壤樣本共得到461 個菌屬，其中以Thiobacillus、Haliangium、Unidentified-Acidobacteria、Unidentified-Deltaproteobacteria四類菌屬豐度值較大。但Thiobacillus在T1 處理中的豐度明顯高于其他四個處理，說明單獨施用氰氨化鈣可以提高Thiobacillus的相對豐度。T3 處理相對于CK，明顯提高了Haliangium的相對豐度。

2.3 不同處理植煙根際土壤細菌群落組成主成分分析

對不同處理植煙根際土壤樣本進行PCA (Principal Component Analysis)分析，結果如圖1 所示。選取的最大程度反映處理間差異的2 個處理，其方差累計貢獻率分別為11.24%和9.75%，其中，T2、T3 與T4 處理中，T2 處理對PC1 的貢獻表現最低，T3 處理與T4 處理差異不大，這說明氰氨化鈣與生物炭配施對土壤樣本細菌群落有明顯影響。T1 處理土壤樣本距離CK處理土壤樣本最遠，說明氰氨化鈣單獨施用對植煙土壤細菌群落影響最大。總體而言，施用氰氨化鈣影響了土壤細菌群落結構，且相比于其他物料配施，氰氨化鈣單獨施用的效果最明顯。

圖1 不同處理植煙根際土壤樣本PCA 分析Fig 1 PCA analysis of rhizosphere soil samples with different treatments

3 討論

本試驗通過對土壤微生物進行高通量測序分析發現，與對照組相比，施用氰氨化鈣的土壤樣本細菌Ace 指數、Chao 指數和Shannon 指數總體上均有所下降，但差異不明顯，其中，T3＞T4＞T2＞T1。這可能是因為施用餅肥能提高土壤中細菌的豐富度和多樣性，生物炭會改變土壤的通透性，影響土壤中厭氧環境條件下的細菌多樣性，氰氨化鈣施入土壤中對于敏感性較強的病原微生物可以起到很好的抑制作用甚至消除，因此導致各處理土壤樣本中細菌多樣性均低于CK 處理，其中以氰氨化鈣單獨施用的處理T1 最低。

土壤中功能微生物的數量可直觀表現土壤養分循環能力以及抗病能力，各處理土壤樣本的主要細菌類群為變形菌門、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門等。純氰氨化鈣處理的土壤樣本變形菌門與酸桿菌門的相對豐度均有所提升。其中，變形菌門具有固氮功能，變形菌門的增多能夠更有效的固定氮源。酸桿菌門是土壤中一類重要的細菌類群，在土壤的生態過程中起著重要的作用。本研究發現，T1 處理土壤樣本中硫桿菌屬的相對豐度顯著高于其他處理，這可能是由于單獨施用氰氨化鈣，為土壤細菌提供了充足的碳源和氮源，促進了細菌的生長繁育。本試驗中，單施氰氨化鈣處理在主成分中與其他處理明顯區別開來，可能是因為，當氰氨化鈣與生物炭或餅肥混施后，其對部分微生物的繁殖的抑制效果大于對部分微生物的繁殖的促進效果，因而對豐富度和均一度造成一定影響。

4 結論

綜合土壤細菌多樣性、結構組成、相對豐度以及主成分分析來看，單施氰氨化鈣的效果最好。氰氨化鈣的施用為土壤提供了充足的碳源與氮源，選擇性消除了土壤中的部分病原微生物，提高了土壤中功能微生物的相對豐度，調節了植煙土壤細菌群落結構，有利于提高土壤的抗病能力，從而達到控制土傳病害的目的。