油酰乙醇胺對糖尿病大鼠腦內(nèi)炎性因子及神經(jīng)相關因子表達的影響

劉金鳳　許東偉　王幼娟　楊武雙

[摘要] 目的 探討油酰乙醇胺（OEA）對糖尿病小鼠腦內(nèi)炎性和神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響。方法 采用高脂高糖加STZ鏈脲佐菌素（STZ）誘導T2DM小鼠模型，OEA[15、30、60 mg/（kg·d）]連續(xù)腹腔注射給藥6周，通過Real time-PCR及Western blot檢測海馬內(nèi)白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、突觸成長相關蛋白-43（GAP-43）、突觸素（SYN）、BDNF和NT-3的mRNA和蛋白表達水平。結果 糖尿病模型小鼠海馬內(nèi)炎癥因子IL-6、IL-1β和TNFα的表達水平下降，并顯著上調(diào)海馬內(nèi)GAP-43、SYN、BDNF和NT3 mRNA表達水平。結論 OEA具有降低糖尿病后海馬內(nèi)炎癥，增加海馬內(nèi)突觸相關因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

[關鍵詞] 油酰乙醇胺;糖尿病腦損害;海馬;神經(jīng)保護

[中圖分類號] R961? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1672-4062（2020）01（a）-0015-03

Effects of Oleoylethanolamine on the Expression of Inflammatory Factors and Neuro-related Factors in the Brain of Diabetic Rats

LIU Jin-feng1， XU Dong-wei1， WANG You-juan1， YANG Wu-shuang2

1.Department of Pharmacy， Xiamen Hospital of Traditional Chinese Medicine， Xiamen， Fujian Province， 361009 China; 2.Department of Neurosurgery， Xiamen Hospital of Traditional Chinese Medicine， Xiamen， Fujian Province， 361009 China

[Abstract] Objective To investigate the effects of oleoylethanolamine（OEA） on inflammatory and neurotrophic factors in the brain of diabetic mice. Methods T2DM mouse model was induced by high-fat， high-glucose and STZ streptozotocin （STZ）， OEA[15， 30， 60 mg/（kg·d）] was administered by intraperitoneal injection for 6 weeks， through Real time-PCR and Western blot analysis of interleukin-6 （IL-6）， interleukin-1β （IL-1β）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， synaptic growth-related protein-43 （GAP-43）， mRNA and protein expression levels of synaptophysin （SYN）， BDNF and NT-3. Results The expression levels of inflammatory cytokines IL-6， IL-1β and TNFα in hippocampus of diabetic mice decreased， and the expression levels of GAP-43， SYN， BDNF and NT3 mRNA in hippocampus were significantly up-regulated. Conclusion OEA can reduce the inflammation in the hippocampus after diabetes， increase the synaptic related factors and neurotrophic factors in the hippocampus， and thus exert neuroprotective effects.

[Key words] Oleoylethanolamine; Diabetic brain damage; Hippocampus; Neuroprotection

2型糖尿病（T2DM）是最常見的內(nèi)分泌疾病之一，患者血糖控制不足，常出現(xiàn)繼發(fā)性并發(fā)癥，繼發(fā)視網(wǎng)膜病變、腎病、心肌病和腦病等多系統(tǒng)損害。糖尿病腦病（DE）或糖尿病相關認知功能減退（DACD），是糖尿病患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一系列神經(jīng)化學、神經(jīng)生理和結構異常，其中包括糖尿病后引發(fā)的認知功能障礙、腦信號傳導異常、神經(jīng)傳遞和突觸可塑性變化以及底層結構改變[1]。雖然糖尿病學習記憶障礙的多因素發(fā)病機制尚不完全清楚，但涉及到晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）的形成和Tau蛋白過磷酸化[2]等因素，都是阿爾茨海默病（AD）的主要病理標志物，因此也有很多人將AD作為2型糖尿病腦病進行研究。

神經(jīng)元丟失是學習記憶能力的結構性缺陷，在突觸紊亂、信號障礙、神經(jīng)遞質(zhì)障礙和認知功能障礙中起著重要作用，由高血糖引起的海馬依賴空間記憶損傷與神經(jīng)元損傷的恢復，甚至是丟失都存在著重要關系，已有大量研究數(shù)據(jù)表明慢性神經(jīng)元丟失是糖尿病與AD聯(lián)系的關鍵機制[3]。因此，可推測具有神經(jīng)保護能力的藥物對糖尿病認知缺陷的治療是具有一定積極作用的。過氧物酶體增殖物激活受體α（PPARα）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，如能量代謝、神經(jīng)傳遞、維持氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)、自噬等。最近研究顯示PPARα受體激動劑具有抑制β淀粉樣沉積、Tau蛋白過度磷酸化和神經(jīng)炎癥作用[4]。然而，PPARα通路對糖尿病腦病的作用尚未在糖尿病小鼠進行測試。

油酰乙醇胺（OEA）是一個有力的內(nèi)源性PPARα激動劑，前期研究表明，長期OEA治療對大鼠腦缺血損傷具有認知功能恢復和神經(jīng)保護作用，另一方面， OEA可通過G蛋白偶聯(lián)受體（GPR） 119的激活有效抑制高血糖。最近的研究表明，OEA類似物丙二酸-2-磺酸-9-烯酰酰胺（N15）在高脂飲食（HFD）和鏈脲佐菌素（STZ）誘導的T2DM小鼠中發(fā)揮降糖作用[5]。在過去的研究中顯示OEA治療可以抑制缺血性中風誘導的細胞炎癥以及具有調(diào)控神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用，而這些作用均由PPARα信號介導[6]。因此，在該研究中，探討了OEA對HFD+STZ誘導的糖尿病小鼠海馬內(nèi)炎癥因子以及神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響，為研究OEA對糖尿病后認知障礙的影響提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1? 材料與方法

1.1? 藥品

油酰乙醇胺（OEA）（廈門大學手性重點實驗室合成提供）。

1.2? 實驗動物

（25±2）g SPF級C57BL/6J雄性小鼠，合格證號為SCXK（京）2016-0041，常規(guī)嚙齒類動物飼料喂養(yǎng)。

1.3? 動物實驗

50只上述雄性C57BL/6J小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為5組，每組10只，除正常組外，其余給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)6周造模，空腹血糖≥11.1 mmol/L為成功，將小鼠隨機分成3組，即模型組、OEA低、中、高劑量治療組，正常組和模型組小鼠分別給予含1%吐溫80的生理鹽水0.2 mL/（kg·d）腹腔注射，其余小鼠隨機分為OEA低、中、高劑量治療組，分別給予OEA 15、30和60 mg/（kg·d）腹腔注射，連續(xù)給藥6周。

1.4? Real time-PCR法檢測

給藥6周后，按照熒光定量PCR檢測試劑盒說明書進行實驗，操作在冰上進行，PCR結束后得到擴增曲線和 Ct值。

1.5? Western blot法檢測

給藥6周后，BCA試劑盒蛋白定量，蛋白通過SDS-PAGE電泳，并通過濕轉轉移到PVDF膜，使用Image Station 4000 R的掃描光密度測定法將蛋白質(zhì)帶可視化和定量。

1.6? 統(tǒng)計方法

采用 Graphpad Prism7.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理分析，實驗結果以（x±s）表示，進行t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2? 結果

2.1? 糖尿病腦病小鼠海馬內(nèi)炎癥因子IL-6、IL-1β和TNFα的表達水平

在給予不同濃度OEA注射給藥6周后，通過Real time-PCR以及western blot對小鼠海馬內(nèi)IL-6、IL-1β和TNFα的mRNA以及蛋白表達量進行測定。如圖1所示，與Normal組相比，DM組小鼠海馬內(nèi)IL-6和IL-1β mRNA以及TNFα的蛋白表達量均明顯增加（P<0.01），在分別給予15、30、60 mg/（kg·d）OEA治療后，小鼠海馬內(nèi)IL-6和IL-1β mRNA下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），海馬內(nèi)TNFα蛋白表達量也明顯降低，因此可以推測OEA可降低II型糖尿病海馬內(nèi)炎癥因子IL-6、IL-1β和TNFα的表達。

2.2? 糖尿病腦病小鼠海馬內(nèi)GAP43、SYN、BDNF和NT3 mRNA表達

在給予不同濃度OEA注射給藥6周后，通過Real time-PCR測定，如圖2所示，與正常組相比，模型組小鼠雙側海馬內(nèi)GAP43和SYN的mRNA明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），小鼠海馬內(nèi)GAP43和SYN mRNA增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），即OEA可對糖尿病后小鼠海馬突觸可塑性進行調(diào)節(jié);同時，小鼠海馬內(nèi)NT3和BDNF的mRNA明顯增加，因此可以推測OEA可明顯提高2型糖尿病后小鼠海馬內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF和NT3的表達。

3? 討論

OEA是一種內(nèi)源性 PPAR-α激動劑，在脂質(zhì)代謝，改善腦供血和增加神經(jīng)功能方面具有多種作用，并且有這方面的報道，而對糖尿病腦部損害的研究未見報道，腦部炎性因子的表達過度可以損害腦功能，炎性因子表達在腦卒中、腦外傷等腦部損害中明顯增加，神經(jīng)相關因子表達下降直接損害腦功能，所以炎性因子和神經(jīng)相關因子在糖尿病腦損害中的表達如何，OEA是否可以降低炎性因子的表達，提高神經(jīng)相關因子的表達，以改善糖尿病的腦損害，為預防和治療提供新的途徑。

已有大量實驗資料表明，體內(nèi)IL-6的異常與多種腦部疾病相關，TNFα是一種典型的促炎細胞因子，其在啟動先天免疫系統(tǒng)的炎癥反應中起重要作用，部分通過誘導其他細胞因子的表達和釋放，通過該次的研究發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)IL-6、IL-1β和TNF-α表達糖尿病組明顯升高，經(jīng)過OEA治療后明顯下降，即說明OEA可以抑制腦內(nèi)炎癥因子的表達，從而發(fā)揮抗炎作用。

海馬區(qū)域的神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)可塑性對許多神經(jīng)系統(tǒng)相關疾病的致病和治療因素敏感。神經(jīng)可塑性是指大腦在一生中適應、改變和重組的能力，突觸可塑性是認知功能的重要方面。為了更好地理解OEA對改善T2DM后認知障礙的作用，該次評估了慢性OEA治療對神經(jīng)可塑性以及突觸可塑性的影響。GAP-43是一種神經(jīng)特異性軸突蛋白，在神經(jīng)突生長調(diào)控、生長錐引導和突觸可塑性等方面發(fā)揮重要作用。SYN是突觸前泡蛋白，在突觸發(fā)生和突觸功能中具有神經(jīng)保護作用，通常反映突觸數(shù)量和密度。該次的數(shù)據(jù)顯示糖尿病小鼠海馬區(qū)的GAP-43和SYN水平顯著下降。這表明這些變化可能與糖尿病后的認知缺陷和神經(jīng)元丟失有關。然而，OEA處理顯著增加了GAP-43和SYN的表達，說明OEA可能通過增強突觸可塑性來改善糖尿病引起的認知障礙。該次的數(shù)據(jù)證實糖尿病小鼠海馬中BNDF和NT3水平下降，而OEA處理顯著提高了BNDF和NT3的水平。這種靶向的改善海馬神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)可塑性可能是降低DE風險和改善DE結果的潛在策略。

綜上所述，結果顯示OEA具有抑制糖尿病后海馬內(nèi)炎癥因子分泌，調(diào)節(jié)神經(jīng)可塑性的作用，而這些作用與糖尿病腦病的進程和發(fā)展息息相關，因此推測OEA是一種具有減輕糖尿病引起的認知功能缺陷的潛力的神經(jīng)保護制劑，可用于糖尿病腦病藥物的研究。

[參考文獻]

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[3]? Pugazhenthi S，Qin L，Reddy PH.Common neurodegenerative pathways in obesity， diabetes， and Alzheimer's disease[J].Biochimica et biophysica acta，2017，1863（5）：1037-1045.

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[6]? Zhou H，Yang WS，Li Y，et al.Oleoylethanolamide attenuates apoptosis by inhibiting the TLR4/NF-kappaB and ERK1/2 signaling pathways in mice with acute ischemic stroke[J].Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology，2017，390（1）：77-84.

（收稿日期：2019-10-12）