藥用蘭科植物分子標記技術研究進展

周龍偉 張良花 李川

摘要? ? 分子標記技術在鑒定植物遺傳多樣性上已被廣泛使用。本文綜述了常用的DNA分子標記（RAPD、AFLP、ISSR等）鑒定藥用蘭科植物遺傳多樣性的研究進展，指出了使用藥用蘭科植物分子標記的問題，并提出了分子標記在藥用蘭科植物資源保護和開發等方面的應用前景。

關鍵詞? ? 藥用蘭科植物;分子標記;遺傳多樣性

中圖分類號? ? S567? ? ? ? 文獻標識碼? ? A

蘭科（Orchidaceae）植物是天門冬目的多年生草本植物，俗稱蘭花，亦叫胡姬花，是開花植物中最大、最具多樣性的科，約800個屬、25 000余種，廣布全球，主產南美和亞洲的熱帶地區。我國有166屬、1 000余種，南北均產，而以云南、海南、臺灣種類最豐富。我國蘭花資源中某些種不但具有很高的觀賞價值，而且具有極高的藥用價值，已知藥用有76屬、287個種[1]，如石斛、白及、黃花白及、天麻、金線蓮、手參、石仙桃等。目前，大多數藥用蘭科植物是野生蘭花，過度采挖使野生蘭科植物的生境被破壞而導致野生資源已瀕臨滅絕。因此，對蘭科植物的研究和保護工作已刻不容緩。本文綜述了近年來利用分子標記技術研究蘭科植物遺傳多樣性的應用與研究進展，為相關研究提供參考。

1? ? 目前蘭科植物利用分子標記的研究現狀

1.1? ? RAPD技術的應用

朱勝男等[2]采用隨機擴增多態性DNA技術對31種石斛屬（Dendrobium）植物的遺傳多樣性進行分析。從100條RAPD引物中共篩選出18條引物，18條引物共擴增出1 082條帶，其中多態性位點有261個，多態性比為99.2%。UPGMA聚類結果顯示，基因型之間的相似系數分布于0.642～0.838之間，31種石斛屬植物樣品分為7類。聚類分析顯示供試樣品完全被區分開，試驗結果與傳統形態分類相似，但又有一定區別。苑? 鶴等[3]利用RAPD分子標記對浙江義烏、天臺、建德、武義，云南麻栗坡、勐海的14個居群的鐵皮石斛和1個居群的紫皮石斛進行遺傳多樣性分析。從225個RAPD引物中篩選出15個引物，對105個鐵皮石斛和3個紫皮石斛樣本進行PCR擴增，共擴增出138條帶，其中133條為多態性條帶，多態性條帶比率（PPB）為96.38%;14個鐵皮石斛居群的多態位點（PPL）在10.79%～76.26%之間，平均為45.32%。結果表明，全國主產區人工栽培的鐵皮石斛遺傳多樣性豐富，鐵皮石斛種質的親緣關系遠近與其地理種源具有顯著的相關性，與栽培地點無關。此外，金? 波等[4]、邱? 婧等[5]、任? 羽等[6]也曾用RAPD技術對石斛的遺傳多樣性進行研究，也都獲得了類似的結果，豐富穩定的擴增多態性證明，RAPD標記技術可以用于石斛屬植物的分類、物種鑒定和遺傳多樣性研究。

王德信[7]以烏天麻、黃天麻和綠天麻3種變型為研究對象，通過RAPD分析研究天麻（Gastrodia elata Bl.）遺傳多樣性，采用改良的CTAB法提取天麻樣品DNA，篩選出重復性好的10條隨機引物，對130個樣品的基因組DNA進行擴增，建立RAPD分析圖譜。結果表明，54條為特異性帶，多態性變異率高達65.1%，說明天麻變異程度較大。聚類分析表明，栽培群體烏天麻是一個高度混雜的群體，雖然個體的表現型基本相同，但從遺傳物質的組成來看，基因型不一致。研究表明，天麻具有豐富的遺傳多樣性，其中烏天麻遺傳多樣性最豐富、變異復雜，為鑒定優質天麻品種、天麻種質資源合理有效利用和進行遺傳育種提供了科學依據。

張? 鐵等[8]以文山地區藥用金線蓮原植物滇越金線蘭（A.chapaensis）及3種葉面特征不同的花葉開唇蘭為材料提取基因組DNA，選擇適合的隨機引物和PCR反應體系，擴增分析金線蓮的帶譜。結果表明，16條引物共得到108條帶譜，其中有95條多態性譜帶，多態百分比為87.96%，且4種材料都具特異性條帶。由此表明，試驗材料之間遺傳差異性較大，花葉開唇蘭可能已經形成了新的變型或變種。獲得的特異性條帶可用于區分干燥的金線蓮藥材。

黃寶華等[9]從100個隨機RAPD引物中篩選出14個多態性較好的引物對15份蝦脊蘭（Calanthe）野生種進行了分析，結果表明，14個RAPD引物共擴增出254條帶，其中多態性帶243條，多態性比率為95.67%;15份蝦脊蘭野生種間的遺傳相似系數的變幅為0.258 8～0.684 8，平均值為0.471 8，表明蝦脊蘭屬植物的遺傳多態性較豐富。

另外，王春香[10]用RAPD技術對斑葉蘭（Goodyera schle-chtendaliana Rchb.f.）遺傳多樣性與群落優勢種群生態位進行了研究。季祥彪等[11]用此技術研究了貴州野生春蘭遺傳多樣性（表1）。

1.2? ? AFLP技術的應用

王慧中等[12]采用AFLP技術分析了13種石斛屬植物的遺傳多樣性，選擇性擴增引物組合E+ACT/M+CAC、E+AAC/M+CAC和E+ACA/M+CAC分別對這13種材料進行擴增，得到豐富的條帶。在100～300 bp共得到346條帶，多態性帶342條，多態性百分率為98.8%。聚類分析結果表明，在相似系數0.54處，可將13種材料分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類。Ⅰ類包括串珠石斛、鐵皮石斛、廣東石斛、重唇石斛、晶帽石斛、細葉石斛、滇桂石斛、報春石斛、玫瑰石斛、球花石斛;Ⅱ類包括鼓槌石斛;Ⅲ類包括美花石斛（花，淺紅）、美花石斛（花，淡白）。AFLP分析結果與傳統分類學的結果基本一致，表明該標記技術對石斛屬植物的遺傳多樣性和分類研究是可行的。

關? 萍等[13]從貴州、云南、四川、陜西和遼寧收集了27份天麻樣品，從64對AFLP選擇性引物組合中篩選出16對組合，對不同分布區天麻的遺傳多樣性進行分析。16對引物共產生548條大小在100～1 500 bp的譜帶，其中多態性帶428條，多態性比率（PP）達78%，說明不同分布區的天麻中存在一定的遺傳多樣性，且AFLP可以有效地進行天麻遺傳多樣性的分析。遺傳差異分析結果表明，27個樣品的遺傳距離為0.018 7～0.593 0，平均為0.219 9，表明不同分布區天麻個體間存在一定的遺傳差異。不同變型的AFLP分析結果顯示，3種變型從分子上無明顯差異，說明天麻種內的變型僅僅是表型上的變異，尚未在遺傳上固定下來，對天麻幾個變型的劃分是否成立還有待進一步研究。程紀倫等[14]利用AFLP技術，采用8對M+3和P+3引物組合對23份貴州野生天麻品種進行了總基因組DNA水平上的多態性檢測，用NTSYSpc-2.10s軟件的UPGMA方法對檢測結果進行聚類。結果共獲得552條可統計的條帶，其中396條呈多態性，多態性帶百分率約為72%。UPGMA聚類可以將貴州不同產地的野生天麻很好地區分開來。其聚類分析結果表明，貴州野生天麻種質豐富的遺傳多樣性，多數來源地相同的天麻種質表現出較為密切的親緣關系。此外，王曉麗等[15]、趙永亮等[16]、謝? 淵等[17]也曾用AFLP技術對天麻的遺傳多樣性進行了相關研究。其結果表明，AFLP技術在天麻的種類劃分、遺傳多樣性研究、親緣關系鑒定上起到重要作用。

朱根發等[18]利用AFLP分析技術，從64對PstI/MseI引物中篩選出9對多態性引物組合，對來源于中國廣東、福建、臺灣的42個墨蘭（Cymbid ium sinense Willd）品種進行了遺傳多樣性和親緣關系分析，共擴增出1 384條帶，其中多態性帶1 333條，多態性率96.3%。平均每對引物擴增帶數154條、多態性帶數148條。所有的品種均可區分，其中39個品種具特征帶或缺失帶。墨蘭品種間的遺傳多樣性豐富，品種間的Dice相似系數為0.422 2～0.824 5，平均相似系數為0.611 2。“達摩”系列芽變葉藝品種間的遺傳多樣性顯著降低，多態性率為76.6%，平均相似系數為0.725 6。聚類分析表明，同一產地來源的品種基本上可聚為一類，反映出了品種間的親緣關系。

管俊杰等[19]以羊耳蒜（Liparis japonica）幼嫩葉片為材料，采用常規SDS法提取基因組DNA，通過優化AFLP反應體系中的幾個關鍵因素，建立適合羊耳蒜的AFLP銀染反應體系，并利用篩選出的引物組合對羊耳蒜的遺傳多樣性進行初步研究。經EcoRⅠ和MseⅠ酶組合37 ℃酶切3 h后可將500 ng基因組DNA完全切開;酶切產物和接頭經16 ℃連接過夜后，用帶有1個選擇性堿基的預擴引物和帶有3個選擇性堿基的選擴引物分別進行擴增，擴增產物經變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染，能夠得到清晰的擴增圖譜。3對引物組合對8個羊耳蒜種群共185個體的擴增共得到221條條帶，其中多態性條帶195條，多態性條帶百分率為88.24%。其研究結果表明，建立的AFLP反應體系可用于羊耳蒜種質資源遺傳多樣性研究（表2）。

1.3? ? ISSR技術的應用

盧家仕等[20]采用ISSR分子標記技術和非加權平均距離法（UPGMA）對24份不同產地石斛屬樣品的遺傳多樣性和親緣關系進行分析，從100條ISSR引物中共篩選出6條多態性穩定、清晰的引物，24份石斛樣品共擴增出847個DNA片段，平均每個引物擴增出141個DNA片段，其多態性為100%。將24份不同產地石斛樣品劃分為6個類群，遺傳多樣性非常豐富。楊春勇等[21]利用ISSR分子標記技術對9種藥用栽培石斛的遺傳多樣性進行研究，從備選的引物中篩選出14條多態性引物，共檢測到179個多態性位點，多態性比率為94.71%，ISSR標記檢測結果顯示，源于不同栽培地區栽培的的石斛屬植物的遺傳多樣性非常豐富。馬佳梅等[22]采用ISSR分子標記技術，對西雙版納分布的蘭科瀕危植物流蘇石斛5個居群共114個個體的遺傳多樣性進行了研究。從100條引物中篩選出了12條用于擴增，共檢測到117個位點，其中105個為多態位點。分析結果表明，流蘇石斛居群水平遺傳多樣性較低，在物種水平上，流蘇石斛多態位點百分率PPB為89.74%，Nei′s基因多樣性指數H為0.322 7，Shannonc s多樣性信息指數Hsp為0.477 9。通過ISSR分子標記技術對石斛的研究，更加確信分子標記技術對石斛的分類、遺傳多樣性與親緣關系鑒定的顯著作用。

關? 萍等[24]利用ISSR分子標記技術，對分布于貴州的藥用植物天麻的9個種群的遺傳多樣性水平和遺傳結構進行分析，用12條ISSR引物共擴增出120條大小為200～1 600 bp的清晰譜帶，其中97條具有多態性，總的多態位點百分率為80.83%，表明在物種水平上有較高的遺傳變異;種群水平的多態性相對較低，多態百分率在17.5%～40.83%之間，平均25.56%。用POPGENE軟件計算各種群間和種群內的遺傳參數，結果表明，物種水平上的Nei′s遺傳多樣性（He）為0.042～0.153，平均為0.07 3;Shannon信息指數為0.332 6±0.224 1;Nei′s基因分化系數（Gst）為0.6377，表明種群間的遺傳變異占總變異的63.77%，而種群內的遺傳變異占總變異的36.23%，這與有限的基因流有關;而種群間有限的基因流（Nm=0.284 1）可能是由于種子的傳播距離、種子極低的生活率以及種群間的地理隔離和營養繁殖等因素所致。

和志嬌等[24]采用ISSR標記對14份小白芨（B.letilla form osana）、5份白芨（B. striata）、2份黃花白芨（B. ochracea）4份未確定種進行了遺傳多樣性的研究，從35個引物中篩選出12個能擴增出清晰帶型并具多態性的引物，共擴增出了124條DNA片段，分子量在259～2 200 bp之間，平均每條引物擴增出10.33條DNA片段，多態性比率為87.90%，采用POPGENE軟件，計算了種間的Nei氏距離，并用UPGMA法構建了系統樹，這25份供試材料明顯聚為3個大類，即小白芨、黃花白芨、白芨，與形態學的分類結果一致，其中根據4份未確定種的親緣關系初步將其歸入了不同的類群。25份白芨種質間的遺傳距離為0.448 3～0.790 3。另外，UPGMA聚類結果表明，不同地理位置采集到的3種白芨樣品種內和種間的遺傳親緣關有明顯的差異。

劉翠華[25]以江西省建蘭（Cymbidium ensifolium）為材料，采用ISSR分子標記進行遺傳多樣性分析，表明17個建蘭居群遺傳距離和地理距離相關性不顯著（表3）。

1.4? ? 其他分子標記技術的應用

樊洪泓等[26]利用SRAP分子標記技術進行藥用石斛的遺傳多樣性研究。采用優化的SRAP反應體系，應用NTSYS軟件對9種石斛的SRAP-PCR結果進行分析，從中篩選得到40對多態性引物組合，共產生1 782條多態性條帶，平均每個引物組合產生44.55條多態性條帶，顯示了較高的多態性比率。聚類分析40對引物組合的擴增結果，供試材料分為2個大類，Jaccard′s遺傳相似系數為0.330 2～0.789 2。SRAP技術可應用于藥用石斛的遺傳多樣性及親緣關系的研究。

白? 堅等[27]采用SRAP分子標記技術對來自四川、臺灣、廣東的47個建蘭品種的遺傳多樣性進行分析，應用NYSYS軟件對SRAP-PCR結果進行聚類分析。結果從88對引物中篩選獲得12對特異性強、穩定性好的引物進行SRAP分析，共擴增出188條帶紋，其中147條為多態性位點，平均每組引物擴增出12條多態性帶。聚類分析表明，47個品種可以分為4個類群：第Ⅰ群由來自四川的3個品種組成;第Ⅱ群的23個品種中有18個來自四川、3個來自廣東、2個來自臺灣;第Ⅲ群的12個品種中有11個品種源于臺灣，1個源于四川;第Ⅳ群僅有1個來自四川，其他品種均來自臺灣。結果表明，由于人工馴化，造成了建蘭品種遺傳背景的混亂，而SRAP分子標記技術能有效地分析建蘭品種的遺傳多樣性和親緣關系（表4）。

2? ? 目前存在的問題

2.1? ? 尚未用到的分子標記技術

近年來，分子標記技術逐漸得到廣泛利用，在藥用蘭科植物上也得到相應的發展。尤其以RAPD技術、AFLP技術、ISSR技術、SRAP技術常見。SSR技術的應用相對較少，其他技術，如RFLP技術、STS技術、TRAP技術、EST技術、SNP技術目前沒有涉及。

2.2? ? 尚未采用分子標記研究的藥用蘭科植物

目前，分子標記技術在石斛、天麻的研究應用中較為廣泛，在其他藥用蘭科植物（如白及、金線蓮、蝦脊蘭等）上的應用并不常見，而在很多種蘭藥用科植物（如手參、石仙桃、杜娟蘭、巖蒜等）還未見相關研究的報道。

2.3? ? 分子標記在實際應用中的問題

與傳統標記（形態標記、細胞標記及生化標記）相比，分子標記有許多優點，其直接在DNA分子上檢測生物間的差異，是在DNA水平上遺傳變異的直接反映。但是，目前分子標記技術依然存在一些問題，主要有標記遺傳圖譜的局限性;與育種目標性狀連鎖分子標記的多態性頻率較低;在DNA提取、定量和PCR擴增以及數據處理等方面的自動化程度較低，所需儀器設備及試劑價格昂貴。

每一種技術都有著一定的局限性，單憑一種分子標記技術的應用去研究其遺傳多樣性，在某一種或者某一類植物上去研究探討是不夠周全的。因此，需要結合多種分子標記技術，對不同類別的蘭科植物進行進一步探索，積累更多的探究結果，從而更好地應用于蘭科植物的遺傳多樣性研究，為蘭科植物的分類、鑒定以及育種、人工營養繁殖奠定基礎。

3? ? 應用前景與展望

蘭科植物中的石斛、天麻、白及、芋蘭、金線蘭、獨蒜蘭、杜鵑蘭、手參等是國家重要的中藥材，由于長期過度開發利用，藥用蘭科植物野生資源遭到嚴重破壞，有些種類的野生資源已近枯竭，加強保護我國藥用蘭科植物已迫在眉睫。

為了保護蘭科植物，合理開發利用藥用蘭科植物種質資源，近年來不少學者致力于分子標記技術在蘭科植物上的研究、應用。可以預見，隨著高通量、低成本和高精度DNA測序新技術的發展，分子標記技術將會更好地應用于藥用蘭科植物的選擇育種、品種改良以及種子純度的鑒定，為研究遺傳多樣性、劃分雜種優勢群提供新方法，為其品種親屬關系鑒定、同一性鑒定提供有力依據。

4? ? 參考文獻

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