再生水灌溉水平對土壤鹽分累積與細菌群落組成的影響

韓 洋，喬冬梅，齊學斌，李 平，郭 魏，崔丙健，陸紅飛，趙宇龍，白芳芳，龐 穎

再生水灌溉水平對土壤鹽分累積與細菌群落組成的影響

韓 洋，喬冬梅，齊學斌※，李 平，郭 魏，崔丙健，陸紅飛，趙宇龍，白芳芳，龐 穎

（1. 中國農業科學院農田灌溉研究所，新鄉 453000；2. 中國農業科學院新鄉農業水土環境野外科學觀測試驗站，新鄉 453000；3. 中國農業科學院農產品質量安全重點開放實驗室，新鄉 453000）

為探明再生水不同灌水水平下土壤鹽分、氮素、磷素與細菌群落組成動態變化效應，采用室內土柱灌水試驗，研究再生水、自來水不同灌水水平對土壤鹽分、氮素、磷素及細菌群落組成結構的影響。結果表明：1）再生水灌溉相比自來水顯著提高了0～60 cm土層鹽分含量、磷素及0～30 cm土層氮素含量也有所提高，降低了土壤細菌群落多樣性和OTU數量；充分灌溉相比非充分灌溉提高了深層土壤鹽分含量，降低了深層土壤細菌群落多樣性和種類數。2）不同處理土壤細菌類群以放線菌門（24.5%～40.6%）和變形菌門（22.4%～30.3%）為主。非充分灌溉下，再生水灌溉相比自來水提高了土壤放線菌門、綠彎菌門、厚壁菌門及酸桿菌門比例，降低了變形菌門比例；充分灌溉下，再生水灌溉相比自來水大幅度提高了土壤放線菌門和硝化螺旋菌門比例，降低了土壤變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門及厚壁菌門比例。無論是在充分灌溉還是非充分灌溉下，再生水灌溉均對土壤放線菌門表現為促進作用，對變形菌門表現為抑制作用。再生水充分灌溉相比非充分灌溉對土壤放線菌門和變形菌門具有促進作用，對土壤綠彎菌門、酸桿菌門和厚壁菌門具有抑制作用；再生水灌水水平越高，越有利于土壤中優勢菌群的生長。3）各處理土壤細菌代謝通路豐度占比最大的為膜轉運、碳水化合物代謝及氨基酸代謝，再生水輔以較高灌水水平能夠顯著促進表層土壤微生物膜轉運、碳水化合物代謝及氨基酸代謝過程。因此，再生水較高灌水水平可促進土壤物質能量循環，且對土壤細菌代謝繁殖過程也可起到積極的調節作用。研究可為再生水灌溉下的土壤生態環境效應研究提供依據。

灌水；鹽分；細菌；再生水；群落組成；代謝功能

0 引 言

隨著經濟發展與人口增長，工農業及生活耗水量與日俱增，淡水資源匱乏現狀愈加受到重視；此外，隨著人均用水量增加，城市污水排放問題也愈加嚴重[1-3]。因此，合理回用污水處理水及再生水對于緩解淡水資源供需矛盾、降低廢棄污水排放的生態環境污染風險意義重大。近年來，國內外學者針對再生水灌溉相關領域展開了多方面研究，主要涉及再生水灌溉對作物生理生長的影響[4-7]、再生水灌溉對土壤環境質量的影響[8-12]、再生水回灌后農田及綠地生態環境系統污染風險評價等方面[13-15]。其中，關于再生水灌溉生態環境效應研究工作多集中于再生水回灌農田及綠地土壤后，土壤鹽分、痕量重金屬、有機污染物、無機污染物等累積和遷移轉化規律的影響[16-22]，而從再生水灌水量調控的角度出發，針對再生水不同灌水水平條件下土壤細菌群落組成結構的影響研究卻少見報道。土壤細菌作為農田土壤生態系統中的重要生物組成部分，其群落結構及功能多樣性與土壤環境質量密不可分[23]；在土壤結構形成、物質循環、腐殖質組成、毒性物質降解及微環境凈化等方面均起到重要的推動作用[24-27]。土壤細菌群落組成可直觀反映土壤微環境中現存的細菌類群、豐度及其與土壤環境間互作下的多樣化程度，特定的細菌群落組成對于維系農田土壤生態功能及改善土壤微環境等方面至關重要[28-29]。因此，通過探明再生水不同灌水水平下的土壤細菌群落組成特征可直觀把握再生水不同灌水量調控下的土壤微環境動態變化機制。為此，本研究通過室內土柱灌水試驗，以再生水和自來水不同灌水水平條件下的土壤為研究對象，探索再生水不同灌水水平對土壤細菌群落組成結構的影響，以期為再生水灌溉下的土壤生態環境效應研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試土壤與試驗用水

試驗用土取自中國農業科學院農業水土環境野外科學觀測試驗站周邊0～20 cm耕層土壤，質地為砂壤土。土樣經風干后剔除動植物殘體及石塊，過2 mm篩，混合均勻后取部分土樣裝入密封袋，帶回實驗室用于測定土壤基本理化性狀，其余土樣封存用于裝填土柱。供試土壤干容重1.42 g/cm3，有機質質量分數為8.68 g/kg，全氮量0.21 g/kg，全磷量0.38 g/kg，電導率值為150.57 dS/m，pH值8.62，重金屬Cd質量分數0.055 mg/kg，Pb質量分數5.357 mg/kg，Cu質量分數10.026 mg/kg，Zn質量分數42.971 mg/kg。

試驗用再生水取自河南省新鄉市駱駝灣污水處理廠，污水來源主要為2017年夏季—2018年夏季城市生活污水，污水處理工藝為A/O反硝化生物濾池及臭氧氧化組合工藝。表1給出本試驗從開始到結束（2017年8月1日—2018年5月28日）每次灌水過程中水樣檢測結果的范圍值。在長達10個月的試驗時間內，再生水水質指標不可避免地在一定范圍內進行波動，2017年9月及2018年5月含鹽量存在輕度超標，而其他常規水質指標均符合農田灌溉水質標準（GB 5084—2005）、再生水水質標準（SL368—2006）和城市污水再生利用農田灌溉用水水質標準（GB 20922—2007）規定（表1）。

表1 試驗用再生水及自來水水質

1.2 試驗設計及過程

試驗設自來水、再生水2種灌水水質，充分灌溉、非充分灌溉2種灌水水平，充分灌水處理保持土壤含水率為田間質量持水率（field water holding capacity，FH）的90%，非充分灌水處理保持土壤含水率為充分灌水處理的70%。共計4個處理，分別為：自來水非充分灌溉（CKDI）、自來水充分灌溉（CKFI）、再生水非充分灌溉（RWDI）、再生水充分灌溉（RWFI），每個處理重復3次。

試驗用土柱填裝容器為硬質PVC管材，外徑 × 高 = 40 cm × 70 cm，壁厚0.98 cm。土柱底部（反濾層位置處）設有排水孔，用于收集尾水，柱體上方布設有管道式灌水系統，每個土柱均在土面上方等間距插入4個滴頭，以保證灌溉水均勻、穩定下滲。柱體由下至上依次是3 cm反濾層、40～60 cm土壤、20～40 cm土壤、0～20 cm土壤，土柱頂部預留7 cm高度不填土以備灌水時利用。分別在柱體各個深度土層埋設土壤負壓計，用于監測土柱不同深度土層土壤水分情況。

供試土壤經自然風干、篩分后，以容重1.42 g/cm3計算每5 cm土層所需填裝的土壤質量，土壤分層由下至上裝入PVC柱內，每個土柱均分12次填裝，每次填裝均保證土壤顆粒分布均勻。在土壤填裝過程中，嚴格將土柱內壁邊緣土壤壓實，以保證灌水時無貼壁水流入滲，盡量避免邊緣效應發生。試驗從2017年8月1日—2018年5月28日于室內進行，充分灌水處理每次灌水量9.70 L，非充分灌水處理每次灌水量6.80 L。灌水周期為20 d，整個試驗周期內累計灌水15次，在試驗開始后的301 d分層取土，分析0～60 cm土層土壤電導率（electrical conductivity，EC）、總氮（total N，TN）及總磷（total P，TP）含量與細菌群落組成結構。

1.3 測試指標與方法

土壤電導率值通過電導法（DDB-303A型便攜式電導率儀，上海雷磁）測定；土壤總氮、總磷量采用流動分析儀（德國BRAN LUEBBE AA3）測定；細菌群落組成通過Miseq高通量測序平臺完成。首先利用脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒（MOBIO Power Soil DNA Isolation Kit）抽提土樣總DNA，取1L提取后的樣品，采用1%瓊脂糖凝膠對土樣總DNA進行電泳檢測，經檢測后得到所有樣品條帶清晰正常，符合檢測標準，從而進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。PCR正式擴增采用Trans Gen AP221-02：Trans Start FastPfu DNA聚合酶，20L反應體系：5×FastPfu緩沖液4L，2.5 mmol/L dNTPs 2L，正向引物（5mol/L）0.8L，反向引物（5mol/L）0.8L，FastPfu聚合酶0.4L，BSA 0.2L，模板DNA 10 ng，補加ddH2O至20L。16S rRNA引物為338F ACTCCTACGGGAGGCAGCAG，806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT。抽取3L擴增后產物，利用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測PCR產物，檢測結果見圖1。電泳檢測結果表明，PCR擴增產物目的條帶均位于750 bp，均為A級，大小正確，濃度合適，擴增結果滿足試驗要求。

注：1～3、4～6、7～9分別為自來水非充分灌溉下0～20、>20～40、>40～60 cm土層；10～12、13～15、16～18分別為自來水充分灌溉下0～20、>20～40、>40～60 cm土層；19～21、22～24、25～27分別為再生水非充分灌溉下0～20、>20～40、>40～60 cm土層；28～30、31～33、34～36分別為再生水充分灌溉下0～20、>20～40、>40～60 cm土層。

1.4 數據處理與分析

應用Excel 2010 和 SAS 9.2對數據進行方差分析；選取95%置信水平，應用最小顯著差異法（least significant difference，LSD）進行不同處理間的多重比較分析。高通量測序結果中，只保留長度介于200～400 bp之間的片斷，舍去小于200 bp和大于400 bp的片段。由于相對含量過小的序列（operational taxonomic units，OTU）不會對細菌群落結構產生顯著影響，因而舍去相對含量小于1%的OUT。利用R語言工具對土壤細菌群落組成進行分析；16S功能預測分析首先利用PICRUSt軟件對樣本OTU進行標準化，排除物種基因組中Copy成分的干擾，進而根據各序列所對應的greengene id，獲得各OTU所對應的COG和KEGG信息，計算COG豐度和KEGG豐度。

細菌多樣性指數計算方法見文獻[30]。Chao指數計算公式為[30]

式中為實際觀測到的OTU數；1為只含有1條序列的OTU數目；為只含有2條序列的OTU數目。

ACE指數計算公式為[30]

式中n表示含有條序列的OTU數；abund為多于“abund”條序列的OTU數，abund為“優勢OTU”閾值，默認為10。

Simpson指數計算simpson公式為[30]

Shannon指數shannon計算公式為[30]

式中obs為實際觀測到的OTU數；為所有序列數。

Coverage指數計算公式為[30]

式中1為所抽樣本中出現的總序列數。

2 結果與分析

2.1 再生水灌水水平對土壤鹽分累積、總氮及總磷分布的影響

試驗結束后不同處理土壤鹽分累積情況、總氮及總磷含量見表2。采用EC代表土壤鹽分狀況，由表可知，無論是在充分灌溉還是非充分灌溉條件下，再生水灌溉下的土壤可溶性鹽含量均顯著高于自來水灌溉（＜ 0.05）。可見，再生水灌溉相比自來水顯著提高了土壤鹽分含量，增加了土壤積鹽風險。因此在再生水工藝處理過程及農業生產回用過程中應嚴格控制水中鹽分含量，避免因長期灌溉而造成土壤鹽漬化，降低土壤質量。再生水不同灌水水平對比分析結果表明，2種灌水水平下的表層0～10 cm土層鹽分含量差異不明顯（＞ 0.05），而在＞10～20 cm土層，充分灌溉顯著低于非充分灌溉（＜0.05），較之降低25.3%；＞20～60 cm土層，充分灌溉則顯著高于非充分灌溉（＜0.05），相比分別提升55.1%、62.9%及122%，平均提升73.5%。綜上，再生水灌溉過程中土壤鹽分累積現象不容忽視，合理控制再生水中鹽分含量水平及優化再生水灌水水平對于降低因再生水灌溉而引起的土壤積鹽風險具有重要的現實意義。

灌溉300 d后，無論是在充分灌溉還是非充分灌溉條件下，再生水灌溉下的0～30 cm土層土壤總氮含量均顯著高于自來水（＜0.05）；充分灌溉條件下，再生水灌溉下的0～10、＞10～20、＞20～30 cm土層總氮含量分別較自來水灌溉提升12.7%、13.9%及17.4%；而在非充分灌溉下，再生水灌溉下的0～10、＞10～20、＞20～30 cm土層總氮含量分別較自來水灌溉提升16.1%、15.4%及11.2%；＞30～60 cm土層無顯著差異（＞ 0.05）。再生水灌溉一定程度上提高了表層土壤總氮含量，2種灌水水平下的0～60 cm各層土壤總氮含量均無顯著差異（＞0.05）。無論是在充分灌溉還是非充分灌溉條件下，再生水灌溉下的0～60 cm各層土壤總磷含量均顯著高于自來水（＜0.05）。再生水灌溉大幅度提高了土壤磷素含量，土壤中磷素含量水平主要受到土壤本身吸附量、植物根系提取量和灌溉及施肥輸入量影響，作物對磷素的吸收途徑主要來源于土壤供給，但由于土壤中絕大部分磷元素吸附于土壤膠體表面，其形態較為穩定且移動性較差，因此輸入到土壤中的磷素絕大部分難以輸出，加之本試驗中土柱不種植作物，磷素主要來源于再生水灌溉。因此推斷導致土壤總磷含量顯著提高的主要原因是再生水工藝處理過程中磷素去除不徹底，水中磷素含量較高。除＞20～30 cm土層外，再生水充分灌溉下各土層總磷含量均顯著高于非充分灌溉（＜0.05）；再生水灌溉下土壤磷素累積狀況受灌水水平的影響顯著，較高灌水水平也伴隨著相對更高的磷素輸入量，因此在再生水回用過程中應合理控制其灌水水平。

表2 各處理不同土層土壤鹽分、全氮及全磷含量

注：同列數據后不同字母表示同一土層不同處理間存在顯著性差異（＜0.05）；CKDI、CKFI、RWDI、RWFI分別代表自來水非充分灌溉、自來水充分灌溉、再生水非充分灌溉、再生水充分灌溉，下同。

Note: Different letters after the same column of data indicate that there is significant difference between different treatments of the same soil layer (＜0.05)，CKDI, CKFI, RWDI and RWFI represent that deficit irrigation with tap water, full irrigation with tap water, deficit irrigation with reclaimed water, full irrigation with reclaimed water, the same as below.

2.2 不同處理土壤細菌稀釋曲線

稀釋曲線主要通過各樣本在不同測序深度下的細菌多樣性指數作為標準來構建曲線，進而反映各樣本在不同測序深度下的物種多樣性，比較測序數據量不同的樣本中所含物種的豐富度、均勻性及多樣性，反映樣本測序情況是否合理[31]。在相似度為97%的水平上，各處理稀釋曲線見圖2。各處理稀釋性曲線均未完全趨于平緩，說明新物種還有可能隨測序深度的增強而不斷增加；隨著測序序列數的增加，4個處理下的土壤細菌稀釋曲線均逐漸趨于平緩，表明測序數量能夠滿足測序要求。

注：橫坐標表示土壤樣品隨機抽取的測序數量，α = 0.03。

2.3 再生水不同灌水水平下土壤細菌群落多樣性分析

Alpha多樣性指數可有效反映某特定生態系統內的物種多樣性情況，較為代表性的度量標準有Chao、Shannon、ACE、Simpson、coverage指數。其中Chao與ACE指數常用來估計物種總量，能夠較好地對樣本豐富度進行評估；Simpson指數常用來在生態學中定量描述一個系統的生物多樣性情況，其值越大，說明細菌群落多樣性越低。Shannon指數與Simpson指數相似，可在一定程度上反映群落alpha多樣性；但其衡量標準與Simpson指數相反，Shannon指數數值越大，則說明細菌群落種類越豐富。Coverage指數可有效反映樣本覆蓋率，其數值越高，則樣本中序列測出概率越高，該指數能夠反映出樣本測序結果的真實性和可靠性。本研究選取97%的相似度水平（= 0.03），對CKDI、CKFI、RWDI、RWFI 4個處理下的不同土層土壤細菌群落alpha多樣性指數進行統計分析見表3。結果表明，非充分灌溉條件下，再生水灌溉相比自來水顯著降低了＞20～40 cm土層ACE指數和Chao指數（<0.05），分別較之降低7.1%和6.4%，對Shannon、Simpson、coverage指數均無顯著影響（>0.05）。而在充分灌溉條件下，與自來水灌溉相比，再生水灌溉顯著降低了0～20 cm、＞ 40～60 cm土層Chao指數和ACE指數（<0.05），分別較之降低4.9%、5.8%和6.3%、5.8%；顯著提高了0～20、＞20～40、＞40～60 cm土層Simpson指數（<0.05），分別較之提升194.3%、80.0%和24.2%。再生水和自來水灌溉下的各土層Shannon指數和coverage指數均無顯著差異（>0.05）。再生水灌溉降低了土壤ACE指數和Chao指數，提高了土壤Simpson指數，可推斷再生水灌溉顯著降低了土壤細菌群落種類數和群落結構多樣性。與非充分灌溉相比，再生水充分灌溉顯著提高了0～20、＞20～40、＞40～60 cm土層Simpson指數，分別較之提升106.3%、15.8%和24.2%；降低了＞40～60 cm土層ACE指數和Chao指數（<0.05），分別較之降低5.1%和5.2%。可見再生水充分灌溉相比非充分灌溉降低了土壤細菌群落結構多樣性及深層土壤細菌豐度。

表3 不同處理下土壤細菌群落多樣性

2.4 土壤鹽分、全氮及全磷與細菌群落多樣性間的相關性分析

土壤鹽分、全氮及全磷與細菌群落多樣性間的相關性見表4。土壤EC值與ACE、Shannon、Chao指數間呈極顯著負相關（＜0.01），與Simpson指數間呈顯著正相關（＜0.05），可見較高的含鹽量會降低土壤中細菌群落多樣性和豐度。土壤TN與ACE、Shannon、Chao指數間呈顯著正相關（＜0.05），與Simpson指數間呈顯著負相關（＜0.05），可見土壤中適度的氮素水平一定程度上有利于促進細菌群落多樣性和豐度的提升。土壤TP與ACE、Chao指數間呈極顯著負相關（＜0.01），與Shannon指數間呈顯著負相關（＜0.05），與Simpson指數間呈顯著正相關（＜0.05），可見土壤中磷素水平偏高不利于細菌群落多樣性的提升。

表4 土壤化學指標與細菌群落多樣性間的相關性

注（Note）：*，＜0.05；**，＜0.01。

2.5 再生水不同灌水水平下土壤細菌OTUs分析

Venn圖可統計不同處理土壤樣本間共有及獨有的物種（OTU）數量，能夠直觀反映出不同處理間物種組成相似性及重疊情況。不同處理OTUs組成及重疊情況見圖 3。0～20 cm土層，CKDI與RWDI共有OTU數2 807，CKFI與RWFI共有OTU數2 703，RWDI與RWFI共有OTU數2 743。此外，CKDI、CKFI、RWDI、RWFI 4個處理獨有細菌種類數分別為150、163、128、97。＞20～40 cm土層，CKDI與RWDI共有OTU數2 910，CKFI與RWFI共有OTU數2 786，RWDI與RWFI共有OTU數2 757。此外，CKDI、CKFI、RWDI、RWFI 4個處理獨有細菌種類數分別為151、132、127、97。＞40～60 cm土層，CKDI與RWDI共有OTU數2 945，CKFI與RWFI共有OUT數2 811，RWDI與RWFI共有OTU數2 836。此外，CKDI、CKFI、RWDI、RWFI 4個處理獨有細菌種類數分別為137、137、124、87。無論是在充分灌溉還是非充分灌溉條件下，與自來水相比，再生水灌溉均降低了0～60 cm土層OTU數；再生水不同灌水水平對比分析結果表明，充分灌溉相比非充分灌溉降低了各土層OTU數。

注：圖中每個區域上數字表示落在該區域上的OTU數量，相似水平為97%。

2.6 再生水不同灌水水平下土壤細菌群落組成分析

在了解各OTU對應的物種后，因存在同一物種對應多個OTU的情況，故將相同物種分類的OTU合并，統計不同土層不同處理下的物種組成變化，探討不同處理下的細菌群落組成。本研究在門水平上基于各處理前10的物種繪制物種組成柱狀圖，并將其他物種均歸類于others，根據物種組成百分比進行相對豐度統計分析，結果見圖4。在門水平上，不同灌溉處理下的土壤細菌類群以放線菌門（actinobacteria占比24.5%～40.6%）和變形菌門（proteobacteria占比22.4%～30.3%）為主，其次為綠彎菌門（chloroflexi占比12.4%～16.4%）、酸桿菌門（acidobacteria占比9.5%～17.9%）、芽單胞菌門（gemmatimonadetes占比3.4%～6.5%）、厚壁菌門（firmicutes占比2.2%～6.1%）、硝化螺旋菌門（nitrospirae占比1.7%～3.5%）、藍細菌門（cyanobacteria占比0.4%～5.9%）等。相同灌水水平條件下，RWDI處理相比CKDI處理提高了＞40～60 cm土層土壤放線菌門比例、0～60 cm土層土壤綠彎菌門和厚壁菌門比例及0～20 cm土層土壤酸桿菌門比例，降低了土壤變形菌門比例；RWFI處理相比CKFI處理大幅度提高了0～60 cm土層放線菌門比例及硝化螺旋菌門比例，降低了土壤變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門及厚壁菌門比例。相同灌水水質下，RWFI處理相比RWDI處理提高了0～60 cm土層放線菌門和變形菌門比例，降低了綠彎菌門、酸桿菌門和厚壁菌門比例。

注：土層20、40和60分別代表0~20、>20~40、>40~60 cm。下同。

根據不同處理不同土層土壤樣品在屬水平上的豐度情況，結合物種與土壤樣品繪制Heatmap圖，進而分析不同物種在不同處理下不同土層中的聚集程度。篩選分類水平總豐度前30的物種，對組內重復樣本豐度取均值，作Heatmap圖。不同處理土壤細菌在屬水平上的相對豐度見圖5。4個處理各土層優勢菌屬均為諾蘭克酸桿菌屬（）和類諾卡氏菌屬（）。再生水灌溉條件下硝化螺旋菌屬（）、馬氏菌屬（）、、-18、等菌屬的相對豐度均高于自來水，鞘脂單胞菌屬（）、、、4-96等菌屬相對豐度均較自來水灌溉有所降低。再生水灌溉相比自來水提高了一部分菌屬的相對豐度，同時也使另一部分菌屬豐度降低，整體最終仍趨于平衡。再生水充分灌溉下，、30--454-96等菌屬相對豐度均低于非充分灌溉，而類諾卡氏菌屬（）、馬氏菌屬（）、硝化螺旋菌屬（）、-18等菌屬的相對豐度均高于非充分灌溉。因此，再生水充分灌溉相比非充分灌溉提高了部分菌屬相對豐度，同時也降低了另一部分菌屬豐度，整體豐度仍趨于平衡。

圖5 不同灌水處理下不同土層土壤細菌在屬水平上的相對豐度

2.7 基于16S的土壤細菌功能預測分析

各土壤樣本細菌COG功能一級分類統計見圖6。不同處理下土壤細菌COG主要功能包括能量生產與轉換、輔酶轉運與代謝、脂質轉運和代謝、氨基酸轉運與代謝、碳水化合物轉運與代謝、無機離子轉運與代謝、一般功能性預測、轉錄、復制、重組和修復、細胞壁生物發生和信號傳導、細胞分裂和染色體分割、核苷酸轉運與代謝、胞體運動、次生代謝產物的生物合成與分解代謝、細胞內物質運輸和分泌、防御、翻譯、翻譯后修飾、蛋白質轉換、核糖體結構形成等功能。箱式圖結果表明，各處理土壤樣本中的細菌代謝功能較為豐富。其中功能豐度值在1 500 000以上的主要有氨基酸轉運和代謝、一般功能性預測、能量生產與轉換以及未知功能類物種；功能豐度介于1 000 000～1 500 000之間的主要有轉錄、信號轉導機制、細胞壁生物發生和信號傳導、碳水化合物轉運和代謝、復制、重組和修復、無機離子轉運與代謝、翻譯、核糖體結構形成、脂質轉運和代謝類物種；其余功能類物種豐度均小于1 000 000。可見，各處理下發揮功能較強的細菌物種主要致力于土壤中氨基酸轉運和代謝、土壤主要能源的生產和循環轉化等過程。此外，功能未知性物種尚有待于進一步探究。

不同處理0～60 cm土層細菌KEGG代謝通路豐度見圖7。4個處理下的0～20、＞20～40、＞40～60 cm土層細菌群落代謝過程富集的通路主要包括能量代謝、氨基酸代謝、核苷酸代謝、碳水化合物合成與代謝、聚糖生物合成與代謝、脂類化合物合成與代謝、維生素等輔助因子代謝、遺傳物質加工和轉錄等多種基本代謝通路、萜類化合物和聚酮類化合物代謝、次生代謝產物的生物合成過程、細胞生長與死亡過程、細胞運動過程、內分泌過程、酶促反應過程、排泄過程、分類和降解過程、遺傳信息處理過程、膜轉運過程、神經系統反應過程、復制和修復過程、信號傳導過程、通路間相互作用過程、轉錄和翻譯過程、運輸和分解代謝過程、異種生物的生物降解和代謝等過程。各處理土壤細菌代謝通路豐度占比最大的主要為膜轉運、碳水化合物代謝及氨基酸代謝。其中，再生水充分灌溉處理下的0～20、＞20～40 cm土層的膜轉運、碳水化合物代謝及氨基酸代謝通路豐度均顯著高于其他3個處理，RWFI處理下的0～20、＞20～40 cm土層膜轉運代謝通路豐度相比RWDI、CKFI、CKDI處理分別提升 16.5%、10.2%、10.1%和12.4%、12.7%、11.2%；RWFI處理下的0～20、＞20～40 cm土層碳水化合物代謝通路豐度相比RWDI、CKFI、CKDI處理分別提升21.4%、15.9%、15.7 %和14.7%、14.6%、10.5%；RWFI處理下的0～20、＞20～40 cm土層氨基酸代謝通路豐度相比RWDI、CKFI、CKDI處理分別提升20.2%、14.7%、13.9%和14.6%、14.7%、10.1%；＞40～60 cm土層差異不顯著。

注：E，氨基酸轉運與代謝；S，未知；R，一般功能預測；C，能源生產和轉換；K，轉錄；T，信號傳導機制；M，細胞壁、細胞膜及包膜生物形成；G，碳水化合物運輸和代謝；L，復制、重組和修復；P，無機離子轉運與代謝；J，翻譯及核糖體結構形成；I，脂質轉運與代謝；H，輔酶轉運與代謝；O，蛋白質轉換及修飾；Q，次生代謝產物的生物合成、運輸和分解代謝；F，核苷酸轉運與代謝；V，防御機制；U，細胞內分泌及膜泡轉運；N，細胞運動及細胞分裂；D，染色體分裂及周期控制；A，RNA加工與修飾；B，染色質結構作用；Z，細胞骨架；W，細胞外結構；Y，細胞核結構代謝。

3 討 論

本試驗通過高通量測序技術研究了再生水不同灌水水平下的土壤細菌群落組成動態變化特征；結果表明，再生水灌溉下土壤細菌群落組成與代謝功能響應特征明顯。土壤細菌多樣性可反映土壤細菌群落狀態、生態特性及土壤環境質量特征，主要包括物種多樣性、結構多樣性、功能多樣性及遺傳多樣性，合理的土壤細菌群落多樣性是維系土壤環境長久穩定發展的重要保障[32-35]。以往研究表明，再生水灌溉可提高土壤細菌群落多樣性[36]，但也有研究指出再生水灌溉下土壤細菌多樣性變化不顯著或呈下降趨勢[37-38]。本研究中，再生水灌溉下ACE和Chao指數相比自來水灌溉有所降低，Simpson指數有所提高，可見再生水灌溉一定程度上降低了土壤細菌群落多樣性。土壤細菌群落多樣性及種群結構受土壤環境中多重因素的動態變化制約[39]；土壤溫度條件、水分條件、有機質含量、可溶性鹽含量、土壤pH等因素的動態變化均會導致土壤細菌多樣性發生顯著改變[40-41]。大量研究表明，再生水中含有較高的鹽分離子，灌溉后極易導致土壤積鹽，增加土壤鹽漬化風險[42-44]。本研究中，再生水灌溉顯著提高了土壤鹽分含量，增加了土壤積鹽風險。土壤鹽分含量的升高一定程度上會對土壤細菌生境條件造成負面效應，從而降低土壤細菌群落多樣性[45]；此外，土壤積鹽易引起土壤pH升高，降低土壤中有機碳活性，進而抑制微生物種群多樣性的提升[40]。因此推斷再生水灌溉土壤細菌多樣性降低的主要原因是再生水灌溉增加了土壤鹽分含量，細菌生長代謝受到土壤中鹽分離子的脅迫，進而降低其多樣性。本研究中土壤鹽分與ACE、Shannon、Chao指數間呈極顯著負相關，與Simpson指數間呈顯著正相關，也證實了土壤中鹽分含量較高會對細菌代謝產生脅迫，從而降低土壤中細菌群落多樣性和豐度。再生水充分灌溉相比非充分灌溉顯著提高了0～60 cm土層Simpson指數，降低了深層土壤ACE和Chao指數，可見充分灌溉一定程度上降低了深層土壤細菌群落多樣性。原因可能是在充分灌溉條件下，再生水向深層土壤輸送的鹽分離子濃度相對更高，進而增加了深層土壤細菌生長代謝受抑制程度，降低其多樣性。

本研究中，各處理土壤細菌類群以放線菌門和變形菌門為主。不同灌水水平下經再生水灌溉后的土壤細菌組成變化與自來水相比存在一定差異；非充分灌溉下，再生水灌溉相比自來水提高了土壤放線菌門、綠彎菌門、厚壁菌門及酸桿菌門比例，降低了變形菌門比例；而在充分灌溉下，再生水灌溉相比自來水大幅度提升了土壤放線菌門和硝化螺旋菌門比例，降低了土壤變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門及厚壁菌門比例。無論是在充分灌溉還是非充分灌溉下，再生水灌溉均對土壤放線菌門表現為促進作用，對變形菌門表現為抑制作用，這與以往研究結果相似[46]。原因可能是放線菌對土壤中各類污染物的抵抗與降解能力較強，在應對外界環境變化時往往表現出較強的耐受性[47]；此外，再生水本身具有較強的水質異質性[48]，不能排除其中還含有部分與放線菌具有協同生存能力的菌種，促進其繁殖。本研究中再生水灌溉刺激了土壤放線菌門的生長繁殖，推斷再生水灌溉一定程度上可促進土壤有機化合物礦化和物質能量循環，降解土壤中毒性物質，不會對土壤環境造成較大的負面影響。變形菌群落范圍分布較廣，大部分類群具有固氮作用[49]。本研究中再生水灌溉抑制了土壤變形菌群的繁殖，初步推斷長期再生水灌溉一定程度上不利于土壤固氮。而導致這種現象的原因可能是土壤中不同菌群之間存在競爭機制[50]，此外由于土壤及灌溉水源中的養分含量有限，且土柱裝置空間封閉，使得變形菌門當中的部分菌屬在與土壤中其他菌群爭奪有限空間和養分的過程中受到抑制，進而降低其整體比例。再生水充分灌溉相比非充分灌溉對土壤放線菌門和變形菌門均具有促進作用，而對綠彎菌門、酸桿菌門和厚壁菌門則起到抑制作用。放線菌門和變形菌門是土壤中占比最大的兩大優勢菌門，本研究中再生水充分灌溉相比非充分灌溉促進了此2種優勢菌門的生長，同時抑制了綠彎菌門、酸桿菌門和厚壁菌門等一類非優勢菌群的生長；可見再生水灌水水平越高，越有利于土壤中優勢菌群的代謝繁殖。

本研究中，再生水輔以較高灌水水平顯著提升了表層土壤細菌膜轉運、碳水化合物代謝及氨基酸代謝過程。碳水化合物代謝過程往往依賴于多種微生物彼此之間相互配合；此外，微生物本身是否具有特定的碳水化合物攝取和代謝基因對于形成良好的代謝網絡至關重要[51]。本研究中再生水充分灌溉處理相比其他各處理顯著提高了表層土壤碳水化合物代謝通路豐度，推斷再生水輔以較高灌水水平一定程度上可增加土壤中攜帶碳水化合物攝取代謝基因的細菌種類及數量，進而使表層土壤碳循環轉化效率得到提升。本研究中，再生水充分灌溉相比其他處理顯著提高了表層土壤氨基酸代謝通路豐度，這可能與充分灌溉條件下再生水向土壤表層輸送的鹽分離子濃度較高有關。相關研究表明，鹽分脅迫會使生物細胞質膜滲透壓升高，影響其滲透調節機制，促使生物體內的氨基酸轉化為糖、糖醇及游離態氨等一類小分子有機物來降低細胞內水勢，進而加速氨基酸代謝過程[52]。除以上代謝通路外，能量代謝、脂類化合物合成與代謝、核苷酸代謝、維生素等輔助因子代謝、轉錄、復制及修復等代謝功能在豐度組成上也占有一定比例；且于再生水充分灌溉條件下0～40 cm土層中，這幾類代謝通路豐度均略高于其他處理。由此可推斷再生水較高灌水水平可在一定程度上促進土壤物質能量循環，此外對土壤細菌代謝繁殖過程也可起到積極的調節作用。

4 結 論

1）再生水灌溉相比自來水顯著提升了土壤鹽分、磷素及表層土壤氮素含量，降低了土壤細菌群落多樣性；充分灌溉相比非充分灌溉提高了深層土壤鹽分含量，降低了深層土壤細菌群落多樣性。

2）土壤細菌類群以放線菌門（24.5%～40.6%）和變形菌門（22.4%～30.3%）為主，與自來水相比，再生水灌溉對土壤放線菌門表現為促進作用，對變形菌門則表現為抑制作用。此外，非充分灌溉下，再生水相比自來水提高了土壤綠彎菌門、厚壁菌門及酸桿菌門比例；充分灌溉下，再生水相比自來水提高了硝化螺旋菌門比例。再生水充分灌溉相比非充分灌溉對土壤放線菌門和變形菌門具有促進作用，而對綠彎菌門、酸桿菌門和厚壁菌門具有抑制作用，再生水灌水水平越高，越有利于土壤中優勢菌群的生長，同時不利于非優勢菌群的代謝繁殖。

3）土壤細菌代謝通路豐度占比最大的為膜轉運、碳水化合物代謝及氨基酸代謝；再生水輔以較高灌水水平能夠顯著促進表層土壤細菌膜轉運、碳水化合物代謝及氨基酸代謝過程。

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Effects of reclaimed water irrigation levels on soil salinity and composition of soil bacteria community

Han Yang, Qiao Dongmei, Qi Xuebin※, Li Ping, Guo Wei, Cui Bingjian, Lu Hongfei, Zhao Yulong, Bai Fangfang, Pang Ying

(1.,,453000,; 2.,,453000,; 3.,,453000,)

Reasonable reuse of reclaimed water is of great significance to alleviate the conflict between supply and demand of fresh water resources and reduce the risk of ecological environment pollution caused by waste sewage discharge. This stud aimed to reveal the effect of different irrigation levels of reclaimed water on soil salinity, total nitrogen, total phosphorus and bacteria community structure. The reclaimed water was collected from a sewage treatment plant. The designed irrigation water sources included reclaimed water and tap water. For each water source, 2 levels of irrigation were designed: full irrigation (90% of field water holding capacity) and deficit irrigation (70% of full irrigation). The soil column experiment was carried out from August 1, 2017 to May 28, 2018. The irrigation amount of full irrigation was 9.70 L per time, and that of deficit irrigation was 6.80 L per time. Water was irrigated every 20 d, and 15 times of irrigation were accumulated in the whole experiment period. Soil sample at 0-60 cm layer was collected after experiment which lasted for 300 days for determination of electrical conductivity, total nitrogen, total phosphorus and bacterial community structure. Soil bacteria diversity index was calculated. The results showed that: 1) Compared with tap water, reclaimed water irrigation significantly increased 0-60 cm soil salinity, total phosphorus content and 0-30 cm soil total nitrogen content, soil bacteria diversity and operational taxonomic units (OUT) were reduced under reclaimed water irrigation. Compared with deficit irrigation of reclaimed water, full irrigation of reclaimed water increased salinity in deep soil, the bacteria diversity and species number in deep soil were reduced under full irrigation of reclaimed water. 2) The soil bacteria under different treatments were mainly actinobacteria and proteobacteria. At deficit irrigation level, compared with tap water, the proportion of soil actinobacteria, chloroflexi, acidobacteria and firmicutes were increased but the proportion of soil proteobacteria were reduced under reclaimed water irrigation. Under full irrigation level, compared with tap water, the proportion of soil actinobacteria and nitrospirae were increased but the proportion of soil proteobacteria, chloroflexi, firmicutes and acidobacteria were reduced under reclaimed water irrigation. Regardless of irrigation levels, the irrigation with reclaimed water promoted soil actinobacteria and inhibited proteobacteria. Compared with deficit irrigation of reclaimed water, full irrigation of reclaimed water promoted soil actinobacteria and proteobacteria, and inhibited soil chloroflexi, acidobacteria and firmicutes bacteria. The high irrigation level of reclaimed water would favor the growth of dominant microorganisms in soil. 3) Membrane transport, carbohydrate metabolism and amino acid metabolism accounted for the largest proportion of bacteria metabolic pathways in all the treatments. Reclaimed water irrigation with high level greatly promoted the bacteria membrane transport, carbohydrate metabolism and amino acid metabolism of surface soil. Therefore, reclaimed water with high irrigation level would promote the cycle of material and energy in soil, and actively mediate the process of soil bacteria metabolism and reproduction.

irrigation; salinity; bacteria; reclaimed water; community composition; metabolic function

韓 洋，喬冬梅，齊學斌，李 平，郭 魏，崔丙健，陸紅飛，趙宇龍，白芳芳，龐 穎. 再生水灌溉水平對土壤鹽分累積與細菌群落組成的影響[J]. 農業工程學報，2020，36(4)：106－117. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.04.013 http://www.tcsae.org

Han Yang, Qiao Dongmei, Qi Xuebin, Li Ping, Guo Wei, Cui Bingjian, Lu Hongfei, Zhao Yulong, Bai Fangfang, Pang Ying. Effects of reclaimed water irrigation levels on soil salinity and composition of soil bacteria community[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(4): 106－117. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.04.013 http://www.tcsae.org

2019-07-24

2019-12-10

國家自然科學基金項目（51879268、51679241、51709265）；中央級科研院所基本科研業務費專項（FIRI2018-02）

韓 洋，實習研究員，主要從事非常規水資源安全高效利用研究。Email：13940585693@163.com

齊學斌，研究員，主要從事農業水資源優化配置與調控研究。Email：qxb6301@sina.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.04.013

S154.3; S155.4+4

A

1002-6819(2020)-04-0106-12