轉PnAlaAT3基因可提高低氮條件下楊樹上位葉谷氨酰胺合成酶活力

張國壁 馬靜 左壯

摘要：谷氨酸氨基轉移酶又稱谷丙轉氨酶，在植物氮同化中起到關鍵作用。本試驗以小黑楊為試材構建pROKⅡ-PnAlaAT3植物表達載體，通過農桿菌介導法轉化小黑楊，獲得轉基因植株，發現5號轉基因株系葉片中PnAlaAT3基因表達量升高，但根中表達量卻顯著降低。對野生型和PnAlaAT3 5號轉基因株系的谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酰胺-α-酮戊二酸氨基轉移酶（GOGAT）活性檢測結果發現，在低氮條件下，PnAlaAT3轉基因株系上位葉GS活LT 較野生型植株有顯著增加。結果表明，PnAlaAT3基因可以提高小黑楊上位葉中GS活力。

關鍵詞：谷丙轉氨酶基因;楊樹;轉基因;氮素同化;谷氨酰胺合成酶活性

中圖分類號： Q785 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）03-0086-04

丙氨酸氨基轉移酶又稱谷丙轉氨酶（Alanine aminotransferase，AlaAT），在磷酸吡哆醛的存在下，該酶可催化丙氨酸和α-酮戊二酸反應，生成丙酮酸和谷氨酸[1-2]。在植物中，該酶位于細胞質中，是氮素同化的關鍵酶[3]。第一個植物AlaAT基因是Muench等從玉米（Zea mays）中分離得到的[4]，之后相繼從擬南芥、大豆、小麥和苜蓿中獲得了多個編碼AlaAT的基因。以擬南芥為例，Igarashi等共鑒定了4個AlaAT基因，分別命名為AOAT1～AOAT4[5]，而大豆[6]和苜蓿[7]也有同樣的家族成員數量。從功能上來看，在擬南芥中過表達外源物種的AlaAT基因可以提高擬南芥的氮素利用效率，而過表達大麥AlaAT基因的水稻（Oryza sativa）和油菜（Brassica nupas）的產量和生物量都發生了顯著的提高[8-9]。過表達大麥AlaAT基因的甘蔗也在低氮條件下表現出了提高氮素利用率的現象[10-11]。

林木AlaAT基因研究相對較晚，2017年，Xu等從楊樹中共克隆得到4個成員，分別命名為PnAlaAT1、PnAlaAT2、PnAlaAT3、PnAlaAT4，其中PnAlaAT1和PnAlaAT2主要表達在葉中，并受日節律的影響，而PnAlaAT3和PnAlaAT4表達量在根中相對較多，其中PnAlaAT3在根中表達量最高，并受外源氮素的調節而顯著上調[12]。但該基因在氮素同化中是否起到關鍵作用尚不清楚。本研究將PnAlaAT3在楊樹體內進行過表達的遺傳轉化，并對轉化株系在不同濃度氮素下的植株生長狀況進行研究，從而推斷該基因在楊樹氮素同化中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采用小黑楊作為試驗材料，取材于東北林業大學試驗林場。pGEM-T Easy載體和大腸桿菌（Escherichia coli） Trans1-T1感受態細胞，購自北京全式金生物技術有限公司;雙元表達載體pROKⅡ和根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105，由筆者實驗室保存;各種限制性內切酶、T4 DNA連接酶、反轉錄試劑盒，均購自TAKARA公司;引物合成委托哈爾濱博士生物科技有限公司完成。其他所需試劑均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 載體構建 根據楊樹來源的PnAlaAT3（GenBank登錄號：KT768062）設計引物PnAlaAT3-F/R：5′-GCTCTAGACCATGGCTCGTGTTTCTCTTG-3′，5′-TCCCCCGGGTCACTCGCGAAACTCCTCC-3′。下劃線分別為XbaⅠ和SmaⅠ的酶切位點。以重組質粒pGEM-T Easy-AlaAT3為模板，用KOD plus高保真酶擴增目的片段，擴增產生的目的基因條帶為 1 446 bp。采用XbaⅠ和SmaⅠ雙酶切將目的片段連接到雙元表達載體pROKⅡ中，構建植物表達載體pROKⅡ-AlaAT3（圖1-A）。在構建的表達載體中，AlaAT3上游啟動子為組成型強啟動子CaMV 35S，終止子為NOS，卡那霉素抗性基因。采用電擊法將重組表達載體pROKⅡ-PnAlaAT3轉入農桿菌EHA105中。

1.2.2 遺傳轉化 以小黑楊為受體物種，采用農桿菌介導法對其進行遺傳轉化。選取長勢好的小黑楊無菌苗的葉片切成邊長為1 cm的正方形小塊，在農桿菌中侵染20 min后取出葉片，接種在不含抗生素的MS[13]（Murashige & Skoog）分化培養基上，于25 ℃條件下黑暗培養2 d。之后將葉片接種到含有50 mg/L卡那霉素（Kan）和300 mg/L頭孢霉素（Cef）的篩選培養基中，在25 ℃、16 h光照/8 h黑暗的條件下培養。待分化的不定芽長到1 cm左右時將其切下，轉移到含有50 mg/L卡那霉素和 300 mg/L 頭孢霉素的抽莖培養基中，待抗性芽長到2 cm時，將其切下并放入含有25 mg/L卡那霉素和300 mg/L頭孢霉素的生根培養基中，繼續培養抗性植株并生根。詳細培養基配方見表1。

1.2.3 轉基因植株的分子檢測 以轉基因小黑楊DNA為模板，用PnAlaAT3基因的特異性引物序列（PnAlaAT3-F，5′-ATGGAAGTCACTGGGTTTGG-3′;PnAlaAT3-R，5′-GAGTAGGCTGCGACAGTAAAAG-3′）進行PCR檢測，目的條帶送樣測序。利用實時熒光定量PCR方法檢測PnAlaAT3基因在轉基因小黑楊中的表達情況，以PtActin基因為內參基因。PnAlaAT3定量引物序列：F：5′-GTTCCTGGCTCTGGCTTTGGG-3′;R：5′-ACTCCGTGAGACGGGAGACAACA-3′。

1.2.4 不同氮素處理及指標檢測 選取健壯的轉化植株和野生型無菌苗，移到滅菌的水培培養液（無蔗糖及瓊脂的MS培養液）中，溫室培養一段時間后，將所有試驗苗分為4組，分別為野生型正常氮組（2 mmol/L NH4NO3）、轉基因正常氮組（2 mmol/L NH4NO3）、野生型低氮組（1 mmol/L NH4NO3）和轉基因低氮組（1 mmol/L NH4NO3）。用上述配置好的營養液裝入水培裝置，把小黑楊材料轉入水培裝置，處理2 d，處理2 d后用吸水紙吸干根部殘留的營養液，收樣，放入-80 ℃保存。其中葉片收樣分為2個部分：第一部分是從小黑楊第1張完全展開的葉片開始依次向下取3張葉片的混樣;第二部分是最下方3張葉片，分別代表小黑楊的新葉（上位葉）及老葉（下位葉）部分。轉氨酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶等的活性用蘇州科銘生物技術有限公司的試劑盒進行檢測。

1.2.5 數據分析 采用SPSS 20.0軟件對轉基因株系與對照在表達水平及表型性狀的差異顯著性進行t檢驗（P=0.05）。所有樣品為5棵苗的混合樣本，生物學重復3次。

2 結果與分析

2.1 轉PnAlaAT3基因的獲得及分子檢測

采用農桿菌介導法，將PnAlaAT3基因轉入小黑楊中，共獲得17棵轉化株系，挑選5、6、7號轉化株系（圖1-B中1～3）進行DNA及RNA等后續檢測，以DNA為模板的PCR檢測結果表明這些條帶的大小約為400 bp（圖1-B），經測序確定為 354 bp，擴增結果與預期相符。這些結果初步證明PnAlaAT3基因已經成功整合到野生型小黑楊的基因組中。將5號轉化株系進行無性擴繁后檢測株高，結果如圖 1-C和圖2所示，野生型平均株高為15 cm，轉化株系平均株高為20 cm，兩者株高差異顯著（P<0.05）。通過熒光定量PCR方法檢測PnAlaAT3基因在該轉化株系根和葉中的表達量，結果如圖3所示，在葉片中，轉基因小黑楊葉片中的基因表達量高于非轉基因的植株;而在根中，轉基因小黑楊中PnAlaAT3基因的表達量顯著低于野生型植株。由此表明，PnAlaAT3基因不僅成功整合到野生型小黑楊的基因組中，并且在小黑楊不同組織中成功表達。

2.2 轉PnAlaAT3基因植株AlaAT酶活變化

為了確定轉PnAlaAT3基因的轉化株系在酶活水平的變化情況，對野生型及轉化株系地上和地下部分酶活進行檢測，結果如圖4所示，在根中，轉基因植株的AlaAT酶活與野生型植株基本一致，但在葉片中轉基因植株的AlaAT酶活相對于野生型植株有顯著的提高。

2.3 轉PnAlaAT3基因小黑楊對氮同化相關基因酶活的影響

GS和GOGAT是氮素同化過程中關鍵的基因，本試驗對不同氮素下轉PnAlaAT3基因株系的谷氨酰胺合成酶（GS）以及谷氨酰受-α-酮戊二酸氨基轉移酶（GOGAT）活力進行檢測，結果如圖5所示，在根中以及下位葉中，GS以及GOGAT活力沒有顯著差異，即使在不同氮素處理的條件下也是如此;在上位葉中，轉PnAlaAT3基因的轉化株系GOGAT活力沒有顯著區別，但GS活力在低氮條件下相對于野生型植株有明顯的提高，且差異達到顯著水平。

3 結論與討論

在植物中，谷丙轉氨酶不僅在逆境條件下發揮一定的作用，在外界氮素發生變化時，該酶也同時起到提高氮素利用的功能[13]。有研究表明，在小麥中氮素利用率的高低與谷丙轉氨酶表達量成正相關[14-15]。在油菜中組成型表達大麥的谷丙轉氨酶基因，結果導致在低氮條件下油菜的氮素利用率提高[9，16]。將大麥AlaAT基因轉入水稻，并加以水稻的根部特異性啟動子，結果導致轉基因水稻分蘗數明顯增加，根更加稠密[8]。同時，轉基因水稻地上

部分的生物量和含氮總量也顯著增加，籽粒產量顯著高于野生型水稻[8]。同時，谷氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸等的含量也發生相應變化[17]。

本研究中將PnAlaAT3基因轉入野生型小黑楊，獲得了過表達株系，在相同生長條件下發現轉基因植株長勢優于野生型植株，株高有顯著增加。且轉基因植株葉片中的AlaAT酶活高于野生型植株葉片中的AlaAT酶活。在低氮處理下，轉化株系的上位葉片中GS活力顯著高于野生型植株，株高也優于野生型植株。GS活力升高會積累更多的谷氨酰胺，以提供給上位葉更多的原材料，從而使轉基因植株長勢更好。

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