環鏈棒束孢(Isaria cateniannulata)殺蟲緩釋劑的制作

張杰 趙丹晨 張麗紅

摘要：以環鏈棒束孢孢子粉為原材料，海藻酸鈉/明膠/淀粉作為包埋劑，采用包埋法制作一種環鏈棒束孢殺蟲緩釋劑，探究環鏈棒束孢孢子粉最適添加量以及緩釋劑壁材的最優配比。結果表明，當孢子粉加入量為0.1 g/mL時，緩釋劑顆粒大小均勻，粒徑約為1.86 mm，成球率達到96.85%，釋放速率平穩，在7 d釋放程度達到66.99%。過高或過低芯材比例均會降低小球的性能。3%海藻酸鈉/0.5%明膠/0.5%淀粉為包埋劑制作出的緩釋劑與4%海藻酸鈉和2%海藻酸鈉/2%明膠為包埋劑所制作出的緩釋劑相比，小球耐受度最高，承重力可達3.53 g，載藥量增至4.08×109 CFU/g，包埋率增至93.78%。

關鍵詞：環鏈棒束孢;海藻酸鈉;包埋劑;緩釋劑;包埋率;孢子粉

中圖分類號： S482.91;S182 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）03-0119-05

環鏈棒束孢別稱環鏈擬青霉，是一種重要的蟲生真菌，在森林生態中的數量和分布僅次于白僵菌[1]。在1976—1977年調查害蟲病原微生物時，從罹病茶樹害蟲中分離得到的病原真菌大多數為擬青霉。梁宗琦經培養鑒定發現有2個新種，其中一種為環鏈棒束孢[2]。目前研究發現，環鏈棒束孢具有一定殺蟲作用：何勁等研究發現，環鏈棒束孢相較于玫煙色擬青霉、蟬擬青霉和細腳擬青霉對小菜蛾的室內毒力最強[3];李豐伯等在對黃山細紋新須螨的防治研究中發現，環鏈棒束孢對其有較高觸殺效果[1];姚婷等在實驗室條件下發現，環鏈棒束孢對線蟲有強降解作用[4];羅力等驗證出環鏈棒束孢在甘藍蚜的防治上具有應用潛力[5];梁宗琦等發現，環鏈棒束孢對茶卷葉蛾和茶小卷葉蛾等茶樹害蟲等有直接觸殺效果，并且致病率較高[6-7];張曉娜等所在的實驗室研究證明，環鏈棒束孢對二斑葉螨也有很好的毒殺效果[8]。環鏈棒束孢在培養基的自然pH值時獲得的產量最高，并且光照對環鏈棒束孢生長和產孢有促進作用[9-10]。由于蟲生真菌具有環境友好和生物學相容的特點，并且符合害蟲防治技術革命的要求，成為目前農林業所研究的重點內容[11]，也是許多國家目前都致力于生防研究的重點問題[12]。蟲生真菌對動物和人均為非致病菌，不會對環境產生污染，無危害。它可以制成不同形式的藥劑，像化學農藥一樣進行噴灑，簡單快捷[13]。

由黃山學院生命與環境科學學院微生物實驗室的李豐伯等制造出的一種太陽能殺蟲器為一種全自動噴灑裝置，使用時放置或懸掛在陽光直射地點，依靠太陽能電池板吸收光能提供動力，將一定量藥劑置于儀器內并在操作面板設定噴灑時間、噴灑份量、每日噴灑次數與時間，由內部齒輪快速旋轉噴出藥劑，從而實現自動化噴灑釋放。此殺蟲器不適合粉劑以及粒徑超過4 mm的藥粉顆粒，適用于粒徑為2 mm左右的藥劑。本研究的目的是制作出一種適用于該裝置的顆粒藥劑。

緩釋釋放劑是一種根據環境條件、有害生物的危害特點和發生規律，采用農藥藥劑加工方法制作出試劑，使農藥按照需要的釋放劑量、固定的釋放時間、穩定持續的釋放速率而釋放[14]，屬于發展迅速的新興領域[15]，其特點可概括為可控、高效、便捷、準確施藥[16]。與傳統劑型相比，緩釋農藥可減少降解[17]、淋溶[18]、蒸發等所帶來的消耗，其制作方法通常包括噴霧干燥法、包埋法、界面聚合法、水相分離法等[19]。本研究采用操作較為簡便快速的包埋法制作緩釋顆粒。包埋法通常使用β-環糊精、殼聚糖、海藻酸鈉、淀粉、明膠等物質作為包埋材料，其中海藻酸鈉是從褐藻類的海帶或馬尾藻中提取碘和甘露醇之后的副產物，因其具有低成本、無毒、可生物降解性、良好的生物相容性等特點在醫藥和農藥緩釋領域當中受到廣泛關注[20-21]。本研究將蟲生真菌與緩釋劑結合，以環鏈棒束孢為殺蟲物質，采用海藻酸鈉為主要包埋材料制作出不同配比緩釋劑，并對其進行性能分析比對，擇優選出一種適用于太陽能殺蟲器的緩釋劑，從而改變向農田直接噴灑孢子粉模式，實現資源利用最大化，避免對資源以及人力所造成的浪費。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株 環鏈棒束孢，來自于貴州大學生命科學學院真菌資源研究所，保存于黃山學院生命與環境科學學院微生物3113實驗室。

于2017年8月至2018年2月在安徽省黃山市黃山學院生命與環境科學學院進行試驗。

1.1.2 主要試劑 主要試劑詳見表1。

1.2 培養基

查氏培養基（Cazpek）：NaNO3 2 g，K2HPO4 1 g，KCL 0.5 g，MgSO4 0.5 g，FeSO4 0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然;將培養基 121 ℃ 下高壓蒸汽滅菌30 min。

1.3 方法

1.3.1 不同濃度環鏈棒束孢緩釋劑的制作 在 1 000 mL 三角燒瓶中配制：3%海藻酸鈉/0.5%明膠/0.5%淀粉溶液1 000 mL，并高壓蒸汽滅菌 121 ℃ 30 min。將環鏈棒束孢孢子粉過100目篩，待包埋劑冷卻至室溫后，按每10 mL混合0、0.5、1.0、1.5、2.0 g孢子粉，分5組，每組3個重復，充分混勻。將配制好的0.2 mol/L氯化鈣溶液置于磁力攪拌器上的燒杯中，使用10 mL一次性無菌注射器（針頭型號為4#）吸取每組混合液，調控磁力攪拌機轉速400 r/min，勻速滴加到0.2 mol/L氯化鈣溶液中，得到顆粒。包埋后的顆粒在室溫下交聯固化 24 h，棄去氯化鈣溶液，使用無菌水清洗顆粒3次，放入35 ℃烘箱中干燥24 h，得到干燥緩釋劑顆粒。

1.3.2 不同材料環鏈棒束孢緩釋劑的制作 在 1 000 mL 三角燒瓶中配制：4%海藻酸鈉溶液（緩釋劑A）、2%海藻酸鈉/2%明膠溶液（緩釋劑B）、3%海藻酸鈉/0.5%明膠/0.5%淀粉溶液（緩釋劑C）各1 000 mL，按照每10 mL加1 g孢子粉的比例，使用 “1.3.1”節的方法制作環鏈棒束孢緩釋劑，3個重復組。

1.3.3 緩釋劑顆粒的成粒情況統計 收集并統計每10 mL各種混合溶液形成的緩釋顆粒的顆粒數，并隨機選取15顆緩釋劑用電子顯數卡尺測量并且計算其平均粒徑。

1.3.4 緩釋劑顆粒的機械強度檢測 從交聯固化好還沒有烘干的環鏈棒束孢緩釋劑中取出大小形狀相當的小球4粒，在平坦的桌面上4個固定點擺成正方形，再在4個小球上面放1個培養皿，隨后慢慢地往培養皿上加砝碼，砝碼質量由小遞增，肉眼觀察，直至小球產生形變，記錄砝碼質量，計算出小球所能承受的最大耐受力：每個小球承重=（培養皿的質量+砝碼質量）/4。

1.3.5 緩釋劑顆粒成球率統計 將每10 mL包埋劑與不同質量孢子粉的混合，制成成型緩釋顆粒的總質量記作m總，10 mL包埋劑所用的包埋試劑質量記作m材，每10 mL加入的孢子粉質量記作mX，每組包埋劑與不同質量孢子粉的混合制成成型緩釋顆粒的比率，記作成球率（granulation rate，GR）。

GR=m總/（m材+mX）。

1.3.6 緩釋劑顆粒載藥量統計 稱取10 g環鏈棒束孢緩釋劑，在研缽中充分研磨至粉末狀，然后倒入盛有90 mL無菌水的三角燒瓶中加入玻璃珠振蕩搖晃10 min左右，使緩釋劑粉末與水充分混勻，采用稀釋涂布法平板法，在查氏培養基上涂布，每組重復3次。在恒溫培養箱中28 ℃下培養3～4 d，對每組1 g緩釋劑中所含孢子數進行統計，所得結果為緩釋劑顆粒的載藥量。

1.3.7 緩釋劑顆粒包埋率統計 包埋劑對孢子粉中孢子的利用率就是緩釋劑顆粒的包埋率（embedding rate，記作ER），把1 g緩釋劑的載藥量記作D，10 mL原料成球總質量記作m總，每10 mL使用的的孢子粉質量記作mX，原材料1 g孢子粉中孢子數記作n，原材料中孢子粉中的孢子數檢測方法同“1.3.6”節。

ER=（D×m總）/（n×mX）×100%。

1.3.8 緩釋劑顆粒溶脹率統計 各取5 g干燥的緩釋劑置于25 ℃的無菌水中，每隔0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、1 d和2 d時間取出所有緩釋劑，濾紙吸干表面水分，稱取t時的濕質量，按下式計算不同時間的溶脹率（swelling ratio，SR）。其中，md表示緩釋劑干質量，mt表示緩釋劑t時濕質量。

SR=（mt-md）/md×100%。

1.3.9 緩釋劑顆粒釋放速率統計 取各種緩釋劑各5 g，放置于三角燒瓶中，倒入250 mL無菌水，三角燒瓶口用保鮮膜密封，室溫下進行緩釋釋放試驗，分別在1 h、2 h、6 h、12 h、1 d、2 d、4 d和7 d吸取1 mL的溶液，采用稀釋涂布法對緩釋釋放液中的孢子數進行檢測，從而計算出各種緩釋顆粒的緩釋速率，每次吸取后補充等量的無菌水至三角燒瓶中密封瓶口。按下式計算不同時間不同緩釋劑的釋放速率，記作RE。

RE=NT/DL×100%。

式中：NT表示T時緩釋劑釋放出的環鏈棒束孢孢子量;DL為這種緩釋劑原本的載藥量。2 結果與分析

2.1 海藻酸鈉/明膠/淀粉不同濃度環鏈棒束孢緩釋劑性質分析

2.1.1 海藻酸鈉/明膠/淀粉不同濃度環鏈棒束孢緩釋劑成粒情況 從表2可以看出，隨著孢子粉在緩釋劑中的濃度增大，形成完整微球的數量呈現出先增大后減小的趨勢，這可能是由于孢子粉比例影響到混合試劑的黏稠度，當孢子粉濃度從 0.15 g/mL 開始，成球顆粒減少，孢子粉濃度為 0.10 g/mL 的緩釋劑顆粒成球率相對較高;微球粒徑、微球的承重力隨著孢子粉濃度的增加而增大，但是隨著孢子粉濃度的增加，顆粒均勻度發生明顯變化，成球難度加大，這是由于孢子粉濃度過高、試劑過稠造成針頭堵塞，制作難度加大，從而影響海藻酸鈉與氯化鈣進行成膜反應。

通過稀釋涂布法測出原材料孢子粉的孢子含量為6.09×109 CFU/g，代入公式計算微球的載藥量和包埋率。圖1和圖2描述了不同孢子粉濃度海藻酸鈉/明膠/淀粉緩釋劑載藥量和包埋率，由圖1和圖2可以明顯看出，隨著孢子粉濃度加大，載藥量也就越大，但是包埋率隨孢子粉濃度增加而遞減。在孢子粉濃度為0.05 g/mL時，微球包埋率表現較好?？赡苁怯捎谛静谋壤募哟?，孢子粉更容易流失，包埋難度增加。一方面減小了海藻酸鈉/明膠/淀粉對芯材的包埋能力，另一方面減小了微球的質量，使載藥率升高。

2.1.2 海藻酸鈉/明膠/淀粉不同濃度環鏈棒束孢緩釋劑溶脹率分析 將固定時間點的每組微球稱取的濕質量代入公式，得出t時的溶脹率。圖3描述了海藻酸鈉/明膠/淀粉不同濃度環鏈棒束孢緩釋劑溶脹動力曲線，從圖3可以明顯看出空白微球溶脹率明顯比加入了孢子粉微球的溶脹率高，加入了孢子粉的微球溶脹程度減半，這說明加入孢子粉對微球的溶脹率有明顯的降低效果，但是加入的孢子濃度不同，對海藻酸鈉/明膠/淀粉微球的溶脹率沒有明顯的影響。

2.1.3 海藻酸鈉/明膠/淀粉不同濃度環鏈棒束孢緩釋劑釋放性能分析 對固定時間點取得的水樣進行稀釋涂布計數，并根據公式計算出每組緩釋劑在相同時間內的釋放率，得到圖4海藻酸鈉/明膠/淀粉不同濃度環鏈棒束孢緩釋劑釋放率。從圖4中可以看出，海藻酸鈉/明膠/淀粉微球釋放率2 d內持續增長，在2 d后達到穩定水平。孢子粉濃度為0.05 g/mL的微球釋放率相較于其他3組的效果差，釋放率較低;0.10 g/mL孢子粉濃度的微球釋放速率較為平穩。孢子粉濃度過高或過低時，緩釋性能變差。孢子粉是通過微球溶蝕或降解釋放擴散至外部環境，芯材比例較大的孢子粉更容易釋放，但孢子粉濃度過高容易使微球崩解，導致緩釋速率不穩定，并且釋放程度也較差。

2.2 海藻酸鈉/明膠/淀粉環鏈棒束孢緩釋劑性質分析

2.2.1 海藻酸鈉/明膠/淀粉環鏈棒束孢緩釋劑成粒情況 使用等量的孢子粉制作出緩釋劑A、B、C。從表3中可以明顯看出，隨著緩釋劑中海藻酸鈉所占比例的減小，小球成球數增加，小球粒徑減小。相較下緩釋劑B成球率較高，但緩釋劑C所制作出的小球大小更均勻，承重效果也最好。

2.2.2 海藻酸鈉/明膠/淀粉環鏈棒束孢緩釋劑溶脹率分析 圖7顯示3種緩釋劑的溶脹率依次表現為C>B>A，緩釋劑A、B在12 h內達到最大溶脹率，緩釋劑C在1 d內達到峰值，之后3種緩釋劑溶脹率開始逐漸下降，可能是由于緩釋劑產生溶蝕，緩釋劑C的下降速度更快，是由于加入了易崩解的淀粉所導致的。

2.2.3 海藻酸鈉/明膠/淀粉環鏈棒束孢緩釋劑釋藥性能分析 從圖8可以看出3種緩釋劑在6 h前釋放速率相當;6 h 后緩釋劑A驟然上升，緩釋劑B、C上升穩定，并且緩釋劑C在2 d后所表現出的釋放率比緩釋劑A和B都高;在7 d后的釋放率表現為C>B>A。這說明海藻酸鈉中加入的明膠和淀粉這2種輔助材料對緩釋劑的釋放速率產生了一定的調控作用。

3 結論與討論

本試驗制作出了以海藻酸鈉為主要原材料的環鏈棒束孢緩釋劑顆粒，其直徑在2 mm左右，當環鏈棒束孢孢子粉加入量為0.1 g/mL時，緩釋劑顆粒的粒徑約為1.86 mm，粒徑較為均勻，與王梅等所制作的巨大芽孢桿菌包埋顆粒[22]相比較顆粒較小，更適用于太陽能殺蟲器;成球率達到 96.85%，釋放率平穩，在7 d后釋放程度達到 66.99%;與宋雙居等所制作出的明膠/海藻酸鈉緩釋微膠囊包埋率[23]相比較，3%海藻酸鈉/0.5%明膠/0.5%淀粉環鏈棒束孢緩釋劑對環鏈棒束孢孢子粉包埋率較高，當孢子粉添加量為0.5 g/mL時，包埋率最高，達98.42%。相對于包埋劑為4%海藻酸鈉或2%海藻酸鈉/2%明膠，3%海藻酸鈉/0.5%明膠/0.5%淀粉作為包埋材料效果較好，此時小球承重力達到3.53 g，載藥量增至4.08×109 CFU/g，包埋率增至93.78%，緩釋速率趨于平穩。本研究僅對環鏈棒束孢緩釋劑顆粒制作工藝進行設計與比對，并未對其進行野外殺蟲試驗，今后研究可以通過與太陽能殺蟲器的結合進行大田試驗，進一步探究其野外殺蟲效果。

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