核桃葉水浸液對蘿卜種子萌發的化感作用

劉序 張如義 楊小建

摘要：探究核桃農林復合經營模式中核桃葉對林下農作物生長的化感效應，以蘿卜種子為受體，采用生物測定法研究不同質量濃度核桃葉水浸液（20 d核桃葉腐解液、40 d核桃葉腐解液和核桃葉浸提液）對蘿卜種子萌發及生理特性的影響。結果表明，（1）核桃葉浸提液（E）、20 d的降解液（D1）和40 d的降解液（D2）均明顯降低了蘿卜種子的發芽率和種子活力指數，并延長了蘿卜種子的平均發芽天數。同時，蘿卜幼苗的苗高、根長和鮮質量在E、D1和D2高質量濃度（H）處理下受到明顯的抑制作用，在低質量濃度（L）處理下表現促進作用。（2）蘿卜種子內抗氧化保護酶活性在核桃葉水浸液E、D1和D2處理下表現出不同的變化規律，對過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）活性表現出抑制效應，但對超氧化物歧化酶（SOD）活性則表現出促進效應;相比于對照（CK），E、D1和D2處理均可以顯著增加蘿卜種子內丙二醛（MDA）的含量，在高質量濃度（EH、D1H、D2H）處理條件下的MDA含量增加最為明顯，分別較CK增加42.1%、44.4%、53.6%。（3）隨E、D1和D2處理液質量濃度的增加，蘿卜種子內滲透調節物質可溶性糖（SS）和可溶性蛋白（SP）含量總體上表現出先增后減的趨勢，且在低或中濃度下促進作用最為明顯，而在高濃度下促進作用逐漸減弱甚至呈現抑制作用。綜上，核桃葉釋放的化感物質一方面通過降低SS、SP含量影響種子內部滲透調節物質累積和抑制各種抗氧化酶的活性而使抗氧化保護酶系統失衡，在兩者共同作用下，受體植物蘿卜種子萌發生長受到抑制。

關鍵詞：核桃葉;蘿卜;水浸液;種子萌發;生理特性;化感作用

中圖分類號： S631.101 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）03-0146-06

化感作用是供體植物分泌到環境中的次生代謝物（化感物質）對自然生態系統及農林農業產生的直接或間接、有利或不利影響的現象[1-2];而化感物質可促進或抑制自然界不同受體植物種子萌發，在其生長發育、群落組成分布及生態系統平衡等過程中扮演重要角色，其主要通過植物殘體分解、根系分泌、揮發、淋洗等4種途徑進入環境[3];種子萌發是植物生命周期中的關鍵環節，正常萌發與否直接關系到作物產量的高低[4]，種子發苗率或者出苗率降低都能導致農作物有效株數下降，進而導致產量降低[5]，因此研究化感物質對農作物種子萌發期間各項生長、生理指標的影響具有重要意義。目前，利用檢測化感物質對受體植物種子萌發的影響是其活性研究的一種常見方法，也是近年來化感效應研究的熱點[6]。

胡桃科（Juglandaceae）核桃屬（Juglans）的核桃（Juglans regia），別稱胡桃、羌桃，是世界著名的四大干果之一，因人們對核桃的營養保健功能和經濟生態效益的了解和重視，近年來，在我國平原及丘陵地區廣泛栽培[7];同時，核桃農林復合經營模式因其具有顯著的經濟和生態效應受到廣泛關注，但研究發現，胡桃科核桃屬的植物多數具有強烈的化感效應，大面積核桃林種植后其誘發的生態環境負效應受到研究學者的普遍關注[8];核桃樹葉或枝條的水浸液對植物的種子萌發和幼苗生長均具有明顯的化感抑制效應[9-11]，且核桃葉降解液對常見大田農作物（麥子、玉米和大豆等）的種子萌發也均有明顯的抑制作用[12-13];但關于核桃葉怎樣影響植物種子萌發及生長的內在機制的研究鮮見報道，目前關于核桃化感作用的研究多采用植物組織浸提法，因此，本試驗采用浸提和降解的方法，模擬核桃葉自然掉落后經過雨霧淋溶和在土壤降解后釋放化感物質的歷程對蘿卜（Raphanus sativus）種子萌發及生理特性的影響，旨在揭示核桃與農作物復合種植模式的可能性及如何有效開展核桃農林復合模式下田間凋落物的科學管理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從四川省內江市農業科學院核桃園內8年生核桃林內收集剛掉落未分解、潔凈的新鮮凋落葉，統一自然風干后，剪成長、寬約為1 cm的小碎塊;土壤選擇當地核桃林下表層農田沙壤土（pH值為7.78，有機質含量為25.33 g/kg，速效磷含量為12.13 mg/kg，速效鉀含量為14.22 mg/kg，全氮含量為0.66 g/kg，全鉀含量為5.59 g/kg，全磷含量為6.61 g/kg），預先過篩，除去雜質，自然晾曬后備用。在四川省內江市農業科學院蔬菜所購買優質蘿卜種子，從中挑選飽滿、大小均勻、優質的種粒，試驗前將種子曬種1 d再浸泡24 h后播種。

1.2 試驗設計

1.2.1 核桃葉水浸液的制備 試驗于2017年5—9月在四川省內江市農業科學院綜合實驗室進行，參照馬世榮等的試驗設計[12，14]，通過浸提和降解2種方法制備核桃葉水浸液，包括核桃葉浸提液（E）、20 d的降解液（D1）和40 d的降解液（D2）;核桃葉水浸液高質量濃度（H）為 100 mg/mL，中質量濃度（M）為50 mg/mL，低質量濃度（L）為25 mg/mL。試驗共設10個處理，即3個核桃葉浸提液處理（EH、EM、EL）、3個20 d降解液處理（D1H、D1M、D1L）和3個40 d降解液處理（D2H、D2M、D2L）、蒸餾水空白對照（CK）。避光條件下冷藏（4 ℃）保存備用。

1.2.2 核桃葉水浸液對蘿卜種子萌發影響的試驗 將挑選后的種子消毒（0.5% H2O2，3 min）處理后分裝到規格（直徑為9 cm）相同、墊有2層濾紙的玻璃培養皿中，每個培養皿中放置50粒，同時加入 5 mL 不同質量濃度的核桃葉水浸液，對照（CK）加5 mL蒸餾水，每個處理重復3次，共計30盤，再將培養皿放入恒溫光照培養箱中培養觀察，每天定時補充等量對應濃度的核桃葉水浸液或蒸餾水，同時，要定期記錄不同處理條件下種子的萌發數量，并于7 d后統計蘿卜種子的發芽率，計算蘿卜種子的活力指數和平均發芽天數，同時，測量蘿卜種子萌發后幼苗的根長（cm）、苗高（cm）、鮮質量（g）等。

1.3 指標測定及試驗方法

1.3.1 種子發芽試驗測定指標 蘿卜種子發芽指標測定：

發芽率（GR）=種子發芽數/種子總 數×100%;

發芽指數（GI）=∑（Gt/Dt）;

活力指數（VI）=GI×S;

平均發芽天數（LMIT）=∑（Gt×Dt）/∑Gt。

式中：S表示7 d后測得的整株鮮質量（g）;Dt表示對應的發芽天數（d）;Gt表示t d后的種子發芽數[15]。

幼苗的根長、苗高采用直尺進行測量;鮮質量采用電子天平測定。

1.3.2 種子生理生化指標 參照王海華等的研究方法[16]，取已萌發48 h后的蘿卜種子，分別測定其過氧化氫酶（CAT）、超氧化物岐化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）的活性和丙二醛（MDA）、可溶性糖（SS）、可溶性蛋白（SP）的含量;其中，SOD活性采用氮藍四唑法[17]測定;POD活性采用愈創木酚法[18]測定;CAT活性采用紫外分光光度法[19]測定;MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法[18]測定;SS含量采用硫代巴比妥酸加熱顯色法[18]測定;SP含量采用考馬斯亮藍G250法[18]測定。

1.4 數據處理

運用SPSS 17.0統計分析軟件（SPSS Inc，USA）對試驗數據開展單因素方差分析（One-way ANOVA），在差異達到顯著水平（P<0.05）下，再通過最小顯著差數法進行多重對比分析。用Excel 2010制表，用Sigmaplot 10.0（Systat Software Inc.，USA）繪圖。

2 結果與分析

2.1 核桃葉水浸液對蘿卜種子萌發指標的影響

由表1可知，在核桃葉浸提液（E）、20 d的降解液（D1）和40 d的降解液（D2）各質量濃度處理下，蘿卜種子發芽率和活力指數均隨處理液濃度的增加而逐漸降低。就種子活力指數而言，EL、EM、EH處理相比CK分別降低27.5%、61.1%、80.4%，D1L、D1M、D1H處理分別降低41.8%、79.5%、91.8%，D2L、D2M、D2H處理分別降低43.3%、78.7%、93.3%。E、D1和D2各質量濃度處理對蘿卜種子幼苗的根長、苗高和鮮質量均表現出低濃度促進、高濃度抑制，而植物的根、莖生長可以通過植物幼苗鮮質量整體體現，本試驗中低濃度核桃葉水浸液對蘿卜幼苗鮮質量有明顯促進作用，相比于CK，EL、D1L、D2L分別增加20.9%、15.0%、12.6%，而在中、高質量濃度核桃葉水浸液處理下幼苗鮮質量受到明顯抑制作用，如EM、D1M和D2M處理相比于CK分別降低6.2%、20.0%、8.9%，EH、D1H、D2H處理分別降低24.6%、46.3%、49.3%。綜上所述，核桃葉水浸液對蘿卜種子萌發、生長各項指標整體上表現為抑制作用，且隨核桃葉水浸液質量濃度的增加，受到的抑制效應就越明顯;相反，隨著水浸液質量濃度的降低，其抑制效應程度逐漸減弱，甚至表現為促進效應。

2.2 核桃葉水浸液對蘿卜種子的抗氧化保護酶活性的影響

由圖1可知，蘿卜種子的POD和CAT活性均隨核桃葉水浸液濃度的增加呈逐漸減弱的變化趨勢。就POD活性而言，EL、EM、EH處理與CK相比，分別下降47.7%、54.4%、62.0%;D1L、D1M、D1H分別下降49.1%、60.1%、68.3%;D2L、D2M和D2H分別下降52.0%、58.4%、71.3%，D2處理的POD活性降幅最大，其次是D1、E處理。而種子SOD活性隨核桃葉水浸液質量濃度的增加逐漸增強;與CK相比，EM、D1M、D2M處理分別增加 8.5%、24.5%、11.1%;EH、D1H、D2H分別增加 18.8%、24.0%、28.7%。綜上，蘿卜種子的SOD、POD和CAT的活性隨核桃葉水浸液種類和質量濃度的不同，呈現不相同的變化規律;POD和CAT活性均隨核桃葉水浸液質量濃度的增加逐漸減弱，而SOD活性卻隨核桃葉水浸液質量濃度的增加而逐漸增強。

2.3 核桃葉水浸液對蘿卜種子內丙二醛含量的影響

由圖1可知，種子的MDA含量隨核桃葉水浸液濃度的增加而不斷升高。與CK相比，EL、EM、EH分別增加24.2%、40.6%、42.1%;D1L、D1M、D1H分別增加24.9%、38.0%、44.4%;D2L、D2M、D2H分別增加33.5%、48.1%、53.6%;高質量濃度（EH、D1H、D2H）處理條件下的MDA含量分別較CK增加42.1%、44.4%、53.6%，MDA含量在D2處理下增幅最大，其次是D1處理，最后是E處理，表明高質量濃度的核桃葉水浸液對蘿卜種子的膜系統產生的過氧化傷害程度最大。

2.4 核桃葉水浸液對蘿卜種子滲透調節物質的影響

由圖2可知，在核桃葉浸提液（E）、20 d的降解液（D1）和40 d的降解液（D2）處理下，蘿卜種子的SS和SP的含量隨處理液質量濃度增加總體上呈先增后減的趨勢。其中，各處理對蘿卜種子的SS含量表現出明顯的促進效應，且在中質量濃度處理下最顯著;如EM、D1M和D2M處理較CK分別增加64.97%、52.31%、52.69%。SP含量的變化規律總體上與SS相似，但在低質量濃度處理下含量最高，如EL、D1L、D2L處理相比于CK分別增加8.1%、5.8%、6.8%。

3 討論

3.1 核桃葉水浸液對蘿卜種子活性氧代謝的影響

化感物質主要通過影響植物種子萌發過程中各種代謝酶的活性和內部正常物質代謝，引起種子活力降低、劣變等現象，最終導致其萌發受到抑制[20];在化感脅迫條件下，植物自身會誘導體內活性氧（ROS）自由基含量的增加，來誘導各種酶促或非酶促清除系統的運行使植物體內ROS的產生與清除處于動態平衡狀態[21]，其中SOD可以催化內部自由基 O-2 · ?向過氧化氫（H2O2）轉化，POD和CAT則可以把植物體內多余的H2O2向H2O轉化，兩者與SOD一起參與到植物抗氧化酶系統的構建，阻止活性氧簇對膜造成傷害[22]，但當這種平衡被打破時，會產生大量的活性氧，致使膜脂過氧化發生，使得細胞氧化和膜系統損傷，同時伴隨有丙二醛的產生[23];因此，MDA含量是反映植物膜脂受損害程度的重要指標[24]。本研究中，蘿卜種子的抗氧化酶活性隨核桃葉水浸液種類和質量濃度的不同呈現出不同的變化規律;SOD活性隨核桃葉水浸液質量濃度的增加逐步增強，說明其發揮著將種子內 O-2 · 歧化為H2O2的功能，而POD、CAT活性均表現出逐漸減弱的變化規律，表明蘿卜種子內POD、CAT清除H2O2的功能受到了抑制，這可能是因為蘿卜種子受到核桃葉水浸液化感脅迫后，產生過多的過氧化物，導致體內各種酶促系統未能起到保護作用[25]。蘿卜種子的MDA含量在低、中、高濃度處理下均明顯增加，在高質量濃度處理下增幅尤為明顯，說明此時核桃葉水浸液對蘿卜種子的膜系統產生的過氧化傷害程度最大。李志萍等在Na2CO3與NaCl脅迫對栓皮櫟的種子萌發及幼苗生長的研究中也得到類似的結論[26]。

3.2 核桃葉水浸液對蘿卜種子滲透調節物質的影響

植物種子萌發初期會通過進行活躍的物質代謝合成來滿足其萌發營養需求，而化感物質正是通過干擾種子萌發過程中能量和物質代謝來影響其萌發[3];王艷青等研究發現，在逆境條件下，植物種子內可溶性蛋白和可溶性糖含量有明顯增加[27]，這主要是因為可溶性糖參與了植物細胞內滲透調節的過程，許多可溶性糖參與了調控植物自身的防御性反應[28];可溶性蛋白含量的增加是由于逆境條件下，種子內部產生較多有毒、有害物質，而這些物質會誘導產生一些逆境蛋白來清除，有助于增強植物對化感脅迫的抗性[3]。本研究中，蘿卜種子可溶性糖、可溶性蛋白含量總體上隨核桃葉水浸液質量濃度的增加逐漸升高，呈先增后減的變化趨勢，并且二者在低或中質量濃度處理下其促進作用最為明顯，而在高質量濃度條件下促進作用逐漸減弱甚至表現出抑制作用。這可能是因為在核桃葉水浸液低或中濃度條件下蘿卜種子對其化感物質表現出明顯的防護效應，主要體現在種子體內細胞主動積累滲透調節物質，可溶性糖、可溶性蛋白含量明顯增加，以降低滲透勢，提高種子細胞的保水能力，提高在化感脅迫下自身修復損傷和防御能力，但當這種化感脅迫超出一定范圍時，也就是在核桃葉水浸液高質量濃度處理下，蘿卜種子內產生過多的過氧化產物，超出了自身調節的閾值，而自身滲透調節物質難以抵抗進而導致種子萌發受到抑制。

3.3 核桃葉水浸液對蘿卜種子萌發的影響

化感物質對植物種子萌發有抑制或促進2個方面作用，這可能與化感物質種類、濃度或者受體植物的種類不同相關[29]，目前，多數研究主要集中在化感物質抑制植物種子萌發方面[20，26，30]。本研究中，核桃葉水浸液對蘿卜種子發芽率和活力指數都有明顯抑制作用，延長了種子平均發芽天數，且隨核桃葉水浸液質量濃度的增加，抑制效應就越明顯;這表明核桃葉水浸液的化感抑制效應與其化感物質的濃度成正相關關系[30]。這與宋亮等研究得到化感物質可以誘發植物種子劣變和降低種子活力，導致種子發芽率下降和發芽時間推遲的結論[20]一致。本研究發現，同一質量濃度下，3種核桃葉水浸液蘿卜種子萌發受抑制程度表現為核桃葉浸提液（E）<20 d的降解液（D1）<40 d的降解液（D2），說明隨時間延長，核桃葉釋放的化感物質呈逐漸增加的趨勢，這與Yang等研究發現，連續種植三七（Panax notoginseng）的土壤能顯著抑制三七種子萌發，且隨種植年限延長抑制效果越明顯的結果[31]一致;本研究中，蘿卜幼苗的苗高、根長和鮮質量在各質量濃度核桃葉水浸液處理下均表現出高濃度抑制、低濃度促進的雙重濃度效應，這與王蓓等的研究結果[11]一致;李茜等也研究發現，核桃葉水浸提液對白術（Atractylodes macrocephala）的株高、地徑、生物量均呈現低促高抑的影響規律[32];這可能與化感物質的專一性和選擇性相關[33]。

4 結論

在自然界中，通常化感物質是溶于雨水后進入環境，進而來影響植物的種子萌發和正常生長，提取化感物質盡量以水作為介質，才能更準確地解釋化感現象。因此，本研究從模擬自然環境中核桃葉經雨霧淋溶和腐解釋放化感物質的歷程發現，核桃掉落葉釋放的化感物質主要通過影響植物種子內部滲透調節物質的累積和酶促系統中抗氧化保護酶的活性，導致種子的內部生理代謝及功能出現混亂，致使種子萌發生長受到抑制。因此，在日常的核桃農林復合經營模式中，要盡量減少和清除林下掉落葉，也可收集堆嘔待充分降解后再還田開展林下種植生產，再通過科學的田間管理和探討合理的農作物套種品種選擇，可以有效促進核桃林下經濟的發展。

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