光合細菌強化生物絮團替代餌料對羅非魚生長、水體環境及水體微生物多樣性的影響

董媛媛 范立民 裘麗萍

摘要：以吉富羅非魚（Oreochromis niloticus）為研究對象，以外加葡萄糖為碳源促進生物絮團的形成以替代部分餌料，設置3個梯度，分別為A組（全部投喂餌料）、B組（替代10%的餌料）和C組（替代20%的餌料），探究光合細菌強化生物絮團對羅非魚生長及水環境狀況的影響，同時采用Biolog-ECO技術研究養殖水中微生物碳代謝多樣性的變化。結果表明，不同餌料替代梯度下的水體微生物碳源的利用程度均隨著培養時間的延長而升高，整體表現為替代10%的餌料>全部投喂餌料>替代20%的餌料;合適的替代率既能增強水體微生物對碳源的整體利用能力，又能節約養殖成本。主成分分析表明，不同餌料替代梯度下的水體微生物群落碳源代謝具有明顯差異，其中聚合糖類、酯類和氨基酸類是水體微生物的偏好碳源，而胺類和酸類的利用率較低。

關鍵詞：光合細菌;生物絮團;餌料替代;微生物群落;羅非魚

中圖分類號： S965.125;S182 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）03-0167-08

羅非魚（Oreochromis niloticus）屬于鱸形目鱸形亞目麗魚科羅非魚屬，原產于非洲內陸水域，又被稱為“非洲鯽魚”。大部分的羅非魚屬于雜食性魚類，常以水體中的植物和碎屑為食。吉富羅非魚是20世紀末世界魚類中心等研究機構利用尼羅羅非魚在菲律賓選育出的羅非魚新品系，適應能力強，遺傳性狀穩定，養殖周期短，生長速度快，是我國目前羅非魚養殖業中的主導品種之一[1]，也是聯合國糧農組織向世界推廣的優良品種之一。隨著水產養殖業的集約化、高產化模式的發展，大量投喂造成的殘餌、糞便堆積及其反應產生的有害物質，不僅對養殖對象本身產生一定的危害，還影響養殖水體環境。

隨著微生物技術的發展，微生物在水產養殖中的研究也日漸深入。微生物種類繁多，分布廣泛，對環境敏感，易變異，且在生物系統中不可替代[2-3]。光合細菌能分解利用養殖水體中的有機物，具有凈化水質、改善水體微生態環境的作用[4]。Biolog-ECO平板法通過直接在微平板上培養微生物群體，測定微生物對不同碳源的利用程度，實時監測其引起的光吸收度變化，借以探究微生物生理特征及其群落結構[5-6]。近年來，關于光合細菌在水產養殖中的應用研究已有不少報道[7-8]。有研究表明，以葡萄糖、蜂蜜、蔗糖等作為外加碳源能夠很好地形成生物絮團[9-12]。由于葡萄糖成本低廉且能夠形成穩定高效的生物絮團，因此，本試驗以葡萄糖作為外加有機碳源，同時向養殖水體中添加光合細菌以進行強化，旨在探究水產養殖中的水質調控問題和生物絮團形成過程中水體微生物群落結構和碳源利用情況，為池塘養殖生物絮團的餌料替代和微生物群落結構的研究提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 養殖管理

養殖試驗于2018年7—8月在江蘇省無錫市中國水產科學研究院淡水漁業研究中心開展，試驗為期60 d。選用9個容積約為1 000 L的圓形養殖桶，試驗前期向養殖桶內加入新鮮表層土壤以提供土著微生物源，然后每桶懸掛1串由全塑性夾片和維綸醛化絲構成的組合填料，其目的是為微生物提供附著基，促進生物絮團的生成，最后每桶加入約 700 L 的水，放置在太陽下充分暴曬，養殖試驗期間為保證充足的供氧，每個養殖桶底部設有微孔增氧管，在提高水體溶解氧濃度的同時，使水體得到充分的攪動混勻。

每個養殖桶放養20尾規格相同的羅非魚，體質量為（6.50±0.50） g，養殖過程中進行相同頻率的投喂，前期投喂量約為羅非魚體質量的10%，后期隨著水體環境和天氣的變化，調整投喂量為羅非魚體質量的2%～3%。試驗設置3個不同的餌料替代梯度，分別為A組（全部投喂餌料）、B組（替代10%的餌料）和C組（替代20%的餌料），每組設3個平行，待養殖水體中的氨水平滿足試驗要求后，開始添加碳源和光合細菌菌液。

1.2 試驗方法

依據中國水產科學研究院淡水漁業研究中心推出的淡水池塘生物絮團生態養殖技術構建操作規程，確定碳源添加量A（g）=H×S×（30×CTAN-N-38），式中：H為池塘平均水深，m;S為池塘面積，m2;CTAN-N為池塘初始氨氮濃度，mg/L。每 2 d 添加1次葡萄糖，添加時間為上午投飼后 30 min，先用養殖水體溶解碳源，然后均勻地潑灑在養殖桶里。光合細菌菌液由實驗室擴大培養，其濃度為 109 CFU/mL，依據陳家長等有關研究[13]確定光合細菌菌液每隔1周使用1次，每次100 mL，總共添加6次。

自生物絮團形成穩定后，每隔1周自水面以下30 cm處采集水樣，進行總磷含量、總氮含量、氨氮含量、亞硝酸鹽含量和pH值等相關指標的測定。采用鉬酸銨分光光度法測定總磷含量;納氏試劑分光光度法測定氨氮含量;N-（1-萘基）-乙二胺光度法測定硝酸鹽含量;pH值采用便攜式pH計測定。待生物絮團穩定后，取適量的水樣用0.85%的NaCl溶液進行稀釋，然后用8孔加樣器加到 Biolog-ECO板中，每孔加150 μL，置于28 ℃恒溫條件下避光培養，用酶標儀分別讀取培養12、24、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180 h時590、750 nm波長處的吸光度。

1.3 統計方法

平均每孔顏色變化率（average well color development，AWCD）[14]計算公式為AWCD=∑（C-R）/n。式中：C代表每個碳源孔的2個波段（590、750 nm）吸光度差值;R代表對照（空白）孔的吸光度;n為Biolog-ECO上碳源種類數量（在本研究中n=31）。本研究選取培養72 h的AWCD數據進行多樣性Shannon指數、Simpson指數、McIntosh指數和豐富度指數的計算，具體參照文獻[15]，同時選取72 h的數據進行微生物對不同碳源利用程度的主成分分析（principal component analysis，PCA）和方差分析（analysis of variance，ANOVA），確定不同組別處理間水中微生物群落代謝的差異，統計分析通過SPSS 25.0統計軟件實現，數據統計和繪圖通過Excel 2016和Origin 8.1來完成。

2 結果與分析

2.1 不同餌料替代梯度對羅非魚養殖效果的影響

如表1所示，減少羅非魚的餌料投喂，以葡萄糖為外加碳源，添加光合細菌進行強化，進行不同比例的餌料替代之后，不同處理組間的終體質量、增質量均表現出差異顯著（P<0.05）;不同處理組間的餌料系數差異不顯著。

2.2 生物絮團對養殖水體水質的影響

如表2所示，C組處理的總磷和氨氮含量顯著低于對照組（P<0.05），總氮和硝酸鹽含量均低于對照組，但差異不顯著;B組處理的氨氮含量顯著低于對照組（P<0.05），總磷、總氮、硝酸鹽含量與對照組相比均差異不顯著，其含量分別比對照組低11.20%、3.41%、29.65%。隨著餌料替代率的增加，除pH值外，不同處理組的水質指標均表現為降低趨勢，其中B組和C組處理之間總磷含量差異顯著（P<0.05）;不同處理組間的pH值差異不明顯。

2.3 生物絮團對養殖水體微生物六大類碳源利用的影響

平均顏色變化率（AWCD）可以有效地反映水體微生物的整體活性，反映微生物對31種碳源的利用能力和偏好。由圖1可知，不同餌料替代梯度下的水體微生物對全部碳源的利用強度均隨著培養時間的延長而呈增加趨勢，12 h以內水體中的微生物活性較低，12～120 h之間，AWCD隨著培養時間的延長而逐漸增大，在120～156 h之間，微生物碳源利用出現先下降后上升的趨勢，156～168 h之間，AWCD逐漸增加而后趨于穩定。不同餌料替代梯度下的AWCD大小順序排序為替代10%的餌料 組> 對照組>替代20%的餌料組，表明替代10%的餌料組微生物碳源代謝強度最高，而替代20%的餌料組對碳源的利用能力整體下降。

由表3可知，進行不同梯度餌料替代之后，B組處理的水體微生物Shannon指數、Simpson指數、McIntosh指數及豐富度指數均高于對照組，但差異不顯著;C組處理均低于對照組。

2.4羅非魚養殖水體中微生物群落對不同碳源利用情況

Biolog-ECO板中包含的31種單一碳源主要分為六大類，即聚合糖類、氨基酸類、酯類、醇類、胺類和酸類。如圖2所示，對于不同程度的替代比例，水體微生物對碳源的利用程度表現出不同的偏好：在對氨基酸類、酯類、胺類和酸類碳源的利用上，替代10%的餌料利用強度最高，而替代20%的餌料則表現為60 h之后對醇類的利用最強;隨著時間的推移，不同處理組對碳源的利用都表現為上升趨勢，在對胺類碳源的利用上，在120～156 h之間表現為先下降后上升最終趨于平穩的趨勢。

為研究生物絮團及光合細菌對水體微生物群落碳代謝的影響，選擇Biolog-ECO培養72 h作為分析時間點，采用SPSS 25.0軟件進行PCA分析，提取3個主成分，第1主成分（PC1）為37.649%，第2主成分（PC2）為19.163%，第3主成分（PC3）為 11.090%，三維主成分綜合了全部31種碳源的 67.902% 的信息，提取前2個主成分進行作圖（圖3），以表征各組水體微生物群落碳源代謝特征，其中前2個主成分積累貢獻率達56.812%。主成分分析中不同處理組間距離的大小表示不同處理組之間的相似水平，間隔越近相似程度越高，對不同碳源的利用能力就越相似。由圖3可知，對照組A主要分布在第一、二象限，處理組B主要分布在第三、四象限，處理組C主要分布在第一、二、三象限，說明處理組B和對照組之間水體微生物碳代謝特征差異明顯，處理組C和對照組之間差異不明顯。

表4列出了31種碳源與3個主成分之間的相關系數， 反映了各個變量對主成分的重要程度，碳源的相關性越高，表明碳源對不同處理的區分的貢獻率越大。但是相關系數較高，不能完全說明該碳源的實際利用程度也高，也有可能是因為不同處理間的碳源利用率差異性高。表4顯示，3組水體微生物代謝基質主成分1相關系數0.55以上的基質有21種，相關系數大于0.75的有7種，其中聚合糖類2種，氨基酸類2種，酯類、胺類和酸類各1種;主成分2相關系數0.55以上的基質僅有4種;主成分3相關系數0.55以上的基質僅有3種，說明不同處理組及對照組間水體微生物代謝功能群落結構的差異主要體現在與主成分1相關系數較高的基質上。與主成分1相關系數在0.80以上的依次為α-D-乳糖、丙酮酸甲脂、L-蘇氨酸和苯乙基胺。

3 討論與結論

3.1 光合細菌強化生物絮團對羅非魚生長的影響

王潮輝等研究發現，在生物絮凝系統構建過程中養殖的吉富羅非魚沒有明顯的應激反應，且其生長要比循環水養殖系統養殖效果更加有利[16]。李朝兵等在生物絮團技術培育小規格羅非魚種的研究中發現，生物絮團可以作為蛋白餌料被羅非魚魚種所攝食利用，提高其生長性能[17]。劉文暢等在無碳源添加的羅非魚養殖系統的研究中發現，水體重復利用的養殖系統中，不額外投加碳源是可行的，其碳源的添加目的是調節水體中的碳氮比例，促進生物絮團的形成[18]。在本研究中，減少餌料投喂，補充葡萄糖和光合細菌來調節水體微生物結構，結果表明，隨著餌料替代率的增加，羅非魚的增質量出現下降趨勢，這有可能是光合細菌的加入對生物絮團的形成或利用產生了影響，并且隨著有機碳替代餌料的比例越高，影響越大，這有可能與有機碳的循環過程發生改變有關。Crab等研究發現，不同類型的外加碳源對生物絮團的營養組成成分的影響具有一定差異，和全部投喂餌料的組相比，不同餌料替代率下的餌料系數差異不顯著，替代20%的餌料處理組餌料系數降低3.8%，可以明顯觀察到羅非魚的生長速度變慢[19]。徐武杰研究發現，在以蔗糖為外加碳源的生物絮團養殖系統中，生物絮團可以提高對蝦胃中脂肪酶、淀粉酶以及蛋白酶的活力[20]。唐匯娟等在零換水條件下添加枯草芽孢桿菌和碳源對羅非魚生長的影響研究中發現，枯草芽孢桿菌和碳源的添加在一定程度上提高了羅非魚的存活率、生長率以及飼料轉化效率，但并未達到顯著水平[21]。而在本研究中，隨著餌料替代率的增加，羅非魚的生長明顯呈下降趨勢，這有可能與外加碳源種類有關，也有可能是因為餌料替代率過大，生物絮團不能完全滿足羅非魚生長的需要，進而限制了羅非魚的生長。生物絮團在養殖生態系統中扮演著很多不同的角色，發揮著關鍵作用[21-24]。在本研究中，生物絮團的組成成分和光合細菌的加入是否影響了羅非魚的某些消化酶活性，進而影響羅非魚生長，還需要通過進一步試驗來驗證。

3.2 光合細菌強化生物絮團對養殖水體水質的影響

盧炳國等在不同C/N水平的生物絮團技術對草魚的研究中發現，C/N為15時最佳，對降低水中的氨氮、亞硝酸鹽水平具有明顯效果[25]。李彥等在養殖水體中以小麥淀粉作為碳源，降低三態氮含量，改善水質，并生成魚類可食用的絮團，降低飼料系數[26]。尚謙對關于木薯渣在生物絮團處理養殖廢水技術的應用研究中提出，蔗糖的添加能夠有效控制氨氮污染[27]。唐肖峰等在碳源對花鰻鱺養殖水質的影響研究中發現，生物絮團組在總磷、總氮、三態氮方面均顯著低于非生物絮團組[28]。在本研究中，替代20%的餌料組總磷、氨氮水平均顯著低于對照組（P<0.05），替代10%的餌料組總磷水平降低11.20%，但差異不顯著，氨氮水平顯著低于對照組（P<0.05）;替代20%的餌料組和替代10%的餌料組硝酸鹽含量分別平均降低44.25%、29.65%，這與上述研究結果趨勢相同。自養硝化反應和異養硝化反應對無機氮都有著良好的降解效能，王濤等研究發現，生物絮團中的異養硝化反應有利于養殖水中無機氮素的脫除，降低養殖水體的富營養化，添加碳源培育生物絮團對氨氮的快速異養轉化的功能在水產養殖中具有重要意義[29-30]。在羅非魚養殖水體中以葡萄糖為外加碳源、以土著微生物為菌源構建養殖系統，利用光合細菌進行強化，能夠進一步對水質進行調控，降低水體中總氮、總磷及氨氮的水平;同時增強水體微生物對聚合糖類、酯類和氨基酸類碳源的利用率，降低對胺類和酸類碳源的利用率。

3.3 光合細菌強化生物絮團對養殖水體微生物群落多樣性的影響

Biolog-ECO平板中的AWCD值反映了微生物群落利用不同單一碳源的整體能力和偏好，在碳源種類相同的條件下，對不同微生物利用碳源情況進行比較，可以反映出不同餌料替代梯度及光合細菌強化下的水體微生物對不同類型的碳源的利用強度存在一定差異[23];其中，替代10%的餌料平均AWCD值最高，對照組次之，替代20%的餌料最低，因此可知適當減少一定的餌料投喂，有利于增強水體微生物群落對碳源的利用。采用不同的多樣性指數，可以反映不同的微生物群落功能多樣性變化[31]。本研究中，隨著餌料替代率的增加，水體微生物多樣性及豐富度無顯著變化，說明碳源添加和光合細菌的加入對水環境中的微生物無顯著影響，這與李志斐等關于生物絮團可增加水體微生物的Shannon指數和豐富度指數的結果[32]相反，與史磊磊等研究的組合填料對羅非魚養殖環境水體微生物多樣性影響結果[33]一致，這可能是與微生物的附著基和外加光合細菌菌液有關。近年來，隨著微生態制劑的發展，其改善養殖環境、維持養殖水體微生態平衡以及促進動物生長的優點不斷在水產養殖中擴大應用。

Biolog-ECO法通過微生物對不同類型碳源的利用程度來反映微生物群落的功能多樣性。其主成分分析可以有效反映微生物群落功能結構特征[34]。平板上的31種碳源主要分為六大類：聚合糖類、氨基酸類、酯類、醇類、胺類、酸類，綜合PC1、PC2和PC3結果可知，不同餌料替代梯度下對水體微生物群落代謝功能起作用的主要碳源類型為聚合糖類、酯類和氨基酸類，不同處理下的差異主要體現在對氨基酸類和酯類碳源的利用上，其中以氨基酸類最為突出。結合不同處理組對不同碳源的整體利用程度可以得出，不同處理的水體微生物對碳源的利用特征差異比較明顯，這一點可能與水體中外加葡萄糖作為碳源有一定的關系，也可能和光合細菌的加入有關。隨著餌料替代率的增加，水體中的微生物多樣性發生了變化，因此作為主要輸入碳源的殘餌和糞便的組成及含量發生了比較明顯的變化，進而影響了水體微生物對不同類型的碳源代謝發生一定的改變，最終影響其對碳源利用的種類和強度。有研究表明，不同碳源產生的胞外聚合物有很大的差異[35]，并且水體中的藻類在光照和二氧化碳充足的條件下，可以產生大量的酯類和碳氫化合物[36]，進一步影響參與生物絮團的組成及其微生物從不同碳源中的獲益方式[37]。張哲等研究發現，系統中微生物群落結構隨添加碳源的不同會發生一定的變化[38];Ballester等研究發現，生物絮團中微生物在維持水質和提供必需營養素方面發揮著重要作用[39]。在本研究中，不同餌料替代下的羅非魚養殖水體微生物分布在不同區域，說明其碳源代謝特征存在一定的差異。主成分分析法可以很好地反映出水質綜合狀態的變化，進而提煉出更多的有用信息[40]。由于Biolog-ECO微平板技術存在一定的局限性，僅采用此技術很難完整地反映不同處理下水體微生物群落功能多樣性的變化規律，有關生物絮團微生物種類等方面的研究，還需進一步探索。適當減少餌料投喂，可以增強水體微生物的碳源代謝能力，減少10%的餌料投喂既能節約養殖成本，又能增強養殖水體微生物對不同碳源的整體利用能力。本研究是在試驗條件下完成，與實際生產中池塘養殖情況還具有一定差距，還需酌情考慮具體的餌料替代比例，同時在選擇添加益生菌強化的過程中，要注意菌種的選擇。

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