基于HPLC與化學計量學方法的防風標準湯劑質量研究＊

張 良，羅 沙，況 玉，魏 屹，譚 睿＊＊

（1. 西南交通大學醫學院 成都 610031；2. 西南交通大學生命科學與工程學院 成都 610031）

防風，最早收載于《神農本草經》，列為草部上品[1]，為風病要藥，功能祛風解表，勝濕止痛，因其能抵御風邪，固有防風之名。今以干燥根入藥，主要產收于我國東北及內蒙古東部[2]。現有研究表明，防風中的成分主要分為為色原酮類、香豆素兩大類，具有鎮靜、抗炎、抗菌、抗驚厥、抗腫瘤、鎮痛等藥理作用[3-7]。

當前我國中藥飲片種類多樣，并存在多種中藥飲片用藥形式，包括配方顆粒、精制飲片、超微飲片、破壁飲片等。同時，受制備工藝的影響，不同生產廠家的產品差別大，致使中藥飲片質量標準不夠明確，臨床用藥劑量難以規范。急需建立規范的可用于標化不同飲片用藥形式和不同廠家產品的標準，以提高臨床用藥的準確性和療效的一致性。陳士林[8]等提出，通過建立中藥飲片標準湯劑標準體系，規范目前臨床廣泛使用的包括配方顆粒在內的新型飲片形式，保障用藥的準確性和劑量的一致性，解決目前飲片形式多樣帶來的監管困境。近幾年來，已有包括白芍、赤芍、當歸、黨參、甘草、葛根、桂枝等數十種中藥飲片標準湯劑的研究[9-15]。楊立偉[16]等通過建立甘草配方顆粒標準湯劑的指紋圖譜，對6 家企業的甘草配方顆粒產品進行了比較，有效確定其質量的差異性。成顏芬[17]等采用指紋圖譜、聚類分析（cluster analysis，CA）和多指標成分含量測定相結合，從整體定性和指標成分定量的角度，標定川芎飲片標準湯劑的化學輪廓和質量控制。

目前，對防風的研究集中在偽品鑒別，藥理作用，活性成分等，曹文正等[18]對11 批防風飲片標準湯劑的升麻素苷，5-O-甲基維斯阿米醇苷進行質量標準探究，但選取的樣本總量少，選取的特征成分未能闡明不同產地間防風飲片的質量差異，也未能進一步研究樣品差異的影響因素。本研究采集15 批防風飲片標準湯劑指紋圖譜信息，結合化學計量學方法，通過CA分析其質量概貌與產地間存在的關聯性，主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLSDA）篩選得到導致不同防風標準湯劑之間有差異而分類的標志性化學成分，同時建立其含量測定方法。測定15 批防風飲片標準湯劑的4 種主要成分的轉移率，干膏得率和pH 值，為防風標準湯劑的質量標準研究及應用提供依據。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（Agilent 型，安捷倫公司），1/10萬電子分析天平（CPA225D 型，賽多利斯科學儀器有限公司），pH 計（pH-100A 型，力辰科技公司），超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。升麻素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為111710-200602、111522-201712、111523-201610，純度均 ＞ 96%）；亥茅酚苷對照品（成都普菲德公司，批號：190110-013，純度 ≥99%），甲醇為HPLC 級（美國Fisher 公司），水為純化水，其他試劑均為分析純。

15 批防風分別采購于河北安國（批號1710131-1710135）、河南安陽（批號FF180311-FF180315）、內蒙赤峰（批號FF180321-FF180325），依次編號為FF-1-FF-15。經西南交通大學宋良科教授鑒定為傘形科植物Saposhnikovia divaricata(Turcz.) Schischk.的干燥根。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX Eclipes Plus C18色譜柱（4.6 ×250 mm，5 μm），流速為1 mL·min-1，流動相甲醇（A）-水（B）梯度洗脫（0-5 min，10%A；5-15 min，10%-36%A；15-20 min，36%-40%A；20-35 min，40%-50%A；35-40 min，50%-60%A；40-47 min，60%-67%A；47-55 min，67%-80%A；55-60 min，80%-100%A），柱溫30℃，進樣量10 μL，檢測波長254 nm。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液

取5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、升麻素苷、升麻素，甲醇為溶劑，制得質量濃度為409、413、430、541 μg·mL-1的對照品母液。

2.2.2 防風標準湯劑

稱取防風飲片約100 g，加7 倍量水，靜置30 min，充分潤透，于圓底燒瓶中加熱回流60 min，紗布濾過；殘渣倒回圓底燒瓶，以6 倍量加熱回流40 min，過濾，將兩次所得濾液合并，60℃減壓濃縮至500 mL，得防風飲片標準湯劑。精密吸取防風飲片標準湯劑1 mL，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，超聲10 min，搖勻，濾過，取續濾液。

2.2.3 防風供試品溶液

取防風飲片細粉約0.25 g，精密稱定，精密加入甲醇10 mL，稱定重量，水浴回流2 h，放置冷卻后，以甲醇補足重量，搖勻過濾，取續濾液。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗

取批號FF180322防風，供試品溶液按“2.2.2”項下方法制備，色譜條件按照“2.1”項下，重復進樣6 次，以5-O-甲基維斯阿米醇苷（6 號峰）為參照峰，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 值均低于0.14%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗

取批號FF180322 防風6 份，供試品溶液按“2.2.2”項下方法制備，色譜條件按照“2.1”項下，進樣檢測，以5-O-甲基維斯阿米醇苷（6 號峰）為參照峰，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 值均低于0.47%，表明方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗

取批號FF180322防風，供試品溶液按“2.2.2”項下方法制備，放置0、4、8、12、16、20、24 h 后分別以“2.1”項下色譜條件進樣，以5-O-甲基維斯阿米醇苷（6 號峰）為參照峰，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 值均低于0.36%，表明該供試品溶液在24 h 內穩定。

2.4 指紋圖譜建立及化學模式識別

2.4.1 HPLC指紋圖譜建立

圖1 15批次防風標準湯劑HPLC指紋圖譜及對照指紋圖譜（R）

圖2 防風標準湯劑的CA結果

按“2.2.2”項下方法制備15 批次防風飲片標準湯劑供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件檢測，采用2012A 版中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統，利用中位數法，時間窗寬度設置為0.5 min，設定FF-12 為參照色譜，經全譜峰匹配后標定了8個共有峰，其共有峰峰面積占總峰面積的69.19%-90.87%。指認出其中4個共有峰，其中4、5、6、8 號峰分別對應、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷。15批防風標準湯劑指紋圖譜及其生成的對照指紋圖譜（R）見圖1。

2.4.2 CA

CA 常用于探究不同數據源間的相似性。采用SPSS 22.0 軟件對15 批樣品進行CA，以8 個共有峰的峰面積為變量，選用WORD 連接法，平方歐氏聚類距離為指標，見圖2。結果發現當判別距離為6 時，可大致為3 類，即樣品S1-S5 歸為一類，樣品S6-S10 為一類，樣品S11-S15為一類，CA 結果表明，各批次防風樣品與產地間存在一定的關聯性，來自同一產地的防風飲片被歸為一類，其藥材質量較為穩定，不同產地的劃分為不同類別，其質量概貌存在差異。

表1 防風標準湯劑的特征值和方差貢獻率結果

2.4.3 PCA

PCA 通過降維處理，在保持原始數據信息的基礎上，簡化目標信息。將15批次防風飲片標準湯劑的共有峰數據導入SPSS 22.0軟件，計算特征值和方差貢獻率。結果見表1，其中兩個主成分特征值大于1，對方差的累計貢獻率為85.82%，說明這兩個主成分在反映不同來源的樣品質量差別關系中起主導作用。圖3為PCA碎石圖，第二個主成分后，曲線坡度變緩，同樣說明這兩個成分是評價樣品質量的代表性變量。因此，可將防風標準湯劑的多個成分簡化為2個主成分進行分析。

圖3 主成分碎石圖

圖4 15批次樣品PLS-DA得分圖

2.4.4 PLS-DA

CA 的結果將防風飲片標準湯劑分為3類，在此基礎上，進行PLS-DA 分析，結果見圖4。3 組樣品聚類良好，分離顯著。采用變量重要性投影（VIP）法分析，對7個差異性標志物進行影響作用排序，見圖5。其中4個標志物VIP 大于1，其影響程度依次為峰3 ＞峰6 ＞峰 4 ＞ 峰 5，經指認，其中6 號峰、4 號峰、5 號峰分別為5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷、升麻素。

2.5 防風飲片標準湯劑中多指標成分的含量測定

2.5.1 線性關系考察

圖5 15批次樣品VIP得分圖

準確吸取“2.2.1”項下對照品母液，以甲醇為溶劑，制成質量濃度分別為9.695 1、38.780 5、48.475 6、96.951 3、145.426 9、169.664 8 μg·mL-1的升麻素苷對照品溶液；1.464 5、5.857 9、14.644 8、18.306 1、21.967 3、25.628 5 μg·mL-1的升麻素對照品溶液；11.308 1、22.616 1、56.540 3、113.080 7、169.621 1、197.891 3 μg·mL-1的5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品溶液；0.655 5、1.310 9、3.277 4、6.554 9、9.832 3、11.471 1 μg·mL-1的亥茅酚苷對照品溶液。色譜條件按照“2.1”項下，以樣品濃度對峰面積進行線性回歸，結果見表2。

2.5.2 精密度試驗

取批號FF180322防風標準湯劑的供試品溶液，色譜條件按照“2.1”項下，連續進樣6 次，結果升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷含量的RSD 分別為0.44%、0.09%、0.41%，0.41%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復性試驗

平行制備6 份防風飲片（批號FF180322）標準湯劑的供試品溶液，色譜條件按照“2.1”項下，結果升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷含量的RSD 分別為1.29%、1.33%、1.69%、1.95%，表明該方法的重復性良好。

2.5.4 穩定性試驗

取批號FF180322 防風飲片標準湯劑的供試品溶液，色譜條件按照“2.1”項下，分別在0、4、8、12、16、20、24 h進樣，結果升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷含量的RSD 分別為0.79%、0.26%、0.85%、0.78%，表明供試品溶液在制備后的24 h 內穩定。

表2 線性關系考察

圖6 樣品含量測定HPLC色譜圖

2.5.5 加樣回收試驗

平行制備6 份防風（批號FF180322）飲片標準湯劑供試品溶液（指標成分濃度分別為升麻素苷22.530 4 μg·mL-1、升麻素3.673 8 μg·mL-1、5-O-甲基維斯阿米醇苷29.017 7 μg·mL-1、亥茅酚苷1.679 8 μg·mL-1），等量添加對照品，按“2.1”項下色譜條件測定，計算升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷的平均加樣回收率分別為97.25%、103.93%、103.16%、106.11%，RSD 分別為3.54%、3.61%、2.87%、1.88%，表明該方法準確可靠。

2.5.6 樣品測定

取15批次防風飲片，供試品溶液按照“2.2.2”項下方法制備，色譜條件按照“2.1”項下，計算各指標成分的含量，結果見圖6和表3。

2.5.7 防風飲片標準湯劑量值傳遞評價指標的測定

轉移率=標準湯劑中指標成分質量/飲片中指標成分質量× 100%，分別計算15 批次防風飲片標準湯劑中升麻素苷，升麻素，5-O-甲基維斯阿米醇苷，亥茅酚苷的轉移率。出膏率=總浸膏質量m/飲片質量M×100%。防風飲片標準湯劑的pH用pH計測定三次，取均值（表3）。

3 討論

在對防風飲片標準湯劑指紋圖譜色譜條件優化的過程中，比較了不同廠家的色譜柱，考察了Waters Sunfire C18（4.6 × 250 mm）、Agilent ZORBAX Eclipes Plus C18（4.6 × 250 mm，5 μm）、Phenomenex Luna Su C18（4.6 × 250 mm），結 果 表 明 Agilent ZORBAX Eclipes Plus C18 色譜柱柱效好，理論塔板數高。篩選了流動相的組成，考察甲醇-水，乙腈-水不同體系，結果表明甲醇-水作為流動相得到的色譜圖分離度較好。比較不同柱溫，最終選擇柱溫為30℃。

表3 防風飲片和標準湯劑的成分含量轉移率及理化參數

參照標準湯劑的要求，本研究制備15批防風飲片標準湯劑，建立了HPLC 指紋圖譜，并導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012A 版軟件，采用平均矢量法進行模式識別。根據匹配結果計算各批次指紋圖譜相似度均＞0.92，匹配確定其中8 個共有峰，指認其中4號峰、5號峰、6號峰、8號峰分別為升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷。

本文在標準湯劑研究的基礎上，結合HPLC 指紋圖譜與化學計量學方法，提供了中藥飲片標準湯劑整體研究的新思路，通過CA 闡明不同產地防風飲片標準湯劑的質量概貌差異性，其結果表明防風樣品與產地間存在一定的關聯性。PCA 可以在盡可能保持原有數據信息的前提下，進行降維簡化，通過PCA 分析降維處理后提取的2 個主成分，在反映不同來源樣品與8 個共有成分的關系中起主導作用，可以代表防風標準湯劑中8 個共有峰的主要信息。PLS-DA 可以表明影響樣品差異性的主要色譜峰，結合變量重要性投影法篩選出具有統計學意義的差異標志物，影響程度依次為峰3 ＞ 峰6 ＞ 峰4 ＞ 峰5。

目前，防風質量研究的定量分析主要集中在升麻素苷，5-O-甲基維斯阿米醇苷，但本研究表明升麻素、亥茅酚苷在指紋圖譜上具有顯著的特征性，并且人源腸Caco-2 細胞單層吸收模型[19]研究顯示，升麻苷和亥茅酚苷具有中等程度的吸收性，表明它們可以通過進入血液循環發揮生物學活性。本研究對防風飲片標準湯劑中的4 種成分進行定量分析，其轉移率依次為升麻素苷52.53%-88.03%、升麻素48.83%-82.85%、5-O-甲基維斯阿米醇苷41.90%-80.45%、亥茅酚苷37.69%-84.49%。在三個產地中，河北安國和河南安陽所產藥材批次間穩定性較好，各批次藥材含量無顯著差別，其成分轉移率較穩定，而內蒙赤峰所產藥材批次間含量差異大，含量低的藥材其成分轉移率波動較大，特征成分轉移率可以作為制備工藝的標尺，用于評價不同廠家生產工藝對中藥制劑的影響。防風標準湯劑中除4 種主要成分外，仍有一些未知成分，其可能在臨床療效的過程中起著作用，本研究以膏率的形式表達了其他多種未知成分的提取率。防風標準湯劑的pH 結果可以作為樣品穩定性考察的指標。

本研究制備得到的15 批防風飲片標準湯劑整體均一性良好，質量穩定，有助于標準化防風飲片的不同臨床用藥形式，解決因生產工藝、制備方法不同而造成的質量差異問題，保障藥物臨床療效的一致性。本研究建立的HPLC色譜條件，既可以同時定量測定4種特征成分，也可以用作評價防風飲片標準湯劑質量標準的特征圖譜，從定量和定性兩個方面保障其質量穩定，可以有效實現防風的整體質量控制，為防風配方顆粒及相關經典名方的研究提供有益參考。