基于ITS2序列的清風藤屬藥用植物分類鑒定研究＊

嚴福林，溫 迪，任得強，王 波，徐文芬，孫慶文，魏升華

（貴州中醫藥大學藥學院 貴陽 550025）

清風藤屬Sabia隸屬于清風藤科Sabiaceae，我國分布 16 種、5 亞種、2 變種，分為清風藤組Sect.Sabia與厚盤組Sect. Pachydiscus，主要集中分布于我國貴州、云南、廣西等西南地區[1,2]。清風藤屬植物大多入藥使用，以小花清風藤藥用最為廣泛，具有清熱利膽、祛風止痛等功效，常用于治療肝炎、風濕痹痛、跌打損傷等疾病，亦為貴州苗族、布依族等少數民族常用藥[3,4]?，F代研究表明，清風藤屬植物主要含有黃酮類、生物堿類及三萜類成分，具有顯著的抗乙肝病毒、保肝護肝、降酶、抗炎等作用[5-12]。此外，清風藤屬植物藤蔓特殊，適應性強，亦是良好的園藝造景植物。可見，該屬植物具有較好的園藝價值和藥物開發價值。

清風藤屬植物花期較短，花瓣易脫落，果實較少，標本往往缺乏重要的鑒定器官，給該屬植物的系統分類學研究和藥材的真偽鑒別帶來了挑戰。王波、劉科成、溫迪等[13-16]在顯微鏡下對清風藤屬植物葉表皮細胞、淀粉、非腺毛、石細胞特征進行觀察，該屬植物的淀粉、非腺毛、葉表皮、石細胞形態、大小及紋孔等方面存在一定差異。郭文凱、孫慶文等[17]采用顯微觀察和數學統計學相結合的方法對凹萼清風藤、平伐清風藤、小花清風藤等9 種清風藤屬種植物葉片表皮細胞顯微表征進行了分析，發現毛被與細胞形態不同。以上研究取得了卓著的成效，為該屬植物的分類及其藥材鑒別提供了重要的參考。Sui 等[18]采用DNA 條形碼技術，考察了trnH-psbA、rbcL-a、matK 3個候選系列在小花清風藤及其混偽品中的鑒定可行性，其中，3個候選系列均能將清風藤屬植物與其他科屬植物分開，matk + rbcL-a 可將小花清風藤與其他科（防己科、衛矛科、茜草科等）的7種植物區別開，為小花清風藤藥材及其偽品的鑒定奠定了基礎。但以上研究在取樣上還有一定局限，研究種類較少，該屬植物的分類與鑒定仍然依靠經驗豐富的專家[19,20]。因此，探求一種準確簡便又行之有效的鑒別方法來鑒別清風藤屬植物的系統分類與鑒定仍然尤為重要。

內部轉錄間隔區2 序列（internal transcribed spacer 2，ITS2）是核基因上位于5.8S rRNA 基因區和大的亞單位編碼區28S之間的一個片段，具有通用性好、變異性高、擴增和測序料率高等優點，是分析動植物系統進化、分類鑒定的較好基因片段。在淫羊藿屬、人參屬、蘭屬、等諸多藥用生物的分類和鑒定中得到了廣泛應用，是鑒定物種屬及物種水平的研究熱點[21-26]。本研究基于前期基礎，對9種清風藤屬藥用植物38個產地樣品進行ITS2序列分析，為清風藤屬植物的分類鑒定與系統學提供參考，為該屬植物的種質資源的保護與可持續開發利用奠定基礎。

1 實驗材料

本研究為清風藤科清風藤屬植物的9 個物種，38份樣品采自貴州、云南、重慶、臺灣4 個地區。對應標本均由貴州中醫藥大學孫慶文教授鑒定，憑證標本存于貴州省生藥重點實驗室標本室。材料信息詳見表1。

2 實驗方法

2.1 樣品DNA的提取與擴增

取硅膠干燥的葉片約20 mg，根據試劑盒（Tiangen Biotech Co.，China）操作提取樣品總 DNA 樣本。候選引物 ITS2，以 50 μL 體系：24 μL Tad PCR Matermix（2×，bluedye）、正反向引物各2 μL，總DNA 模板2 μL，ddH2O 20 μL 進行 PCR 擴增；擴增程序均為：94℃，5 min；94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，45 s；40 cycles；72℃，10 min。引物序列為 ITS2（堿基序列（5'-3'））：2FATGCGATACTTGGTGTGAAT，3R-GACGCTTCTCCAGACTACAAT。經瓊脂糖凝膠電泳中檢測，條帶單一且清晰的PCR產物送至上海生工純化及測序。

表1 樣品信息表

2.2 數據處理方法

測序后所得峰圖應用Codon Code Aligner V 8.0.2（CodonCode Co.，USA）軟件進行校對拼接，去除引物區和低質量序列。所得各序列經ClustalX V 2.0（Higgins D.G）進行多序列比對并查錯；再應用The ITS2 Database在線工具（http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/）進行注釋剪切，去除序列兩端5.8S 和28S 區；應用Geneious V 10.0.02 軟件分析ITS2 序列的組成和結構特點；使用MEGA V 7.0軟件計算（Kimura 2-parameter，K2P）距離值，比較ITS2序列的種間、種內變異，應用最大似然法（maximum likelihood，ML）構建系統發育樹。

3 結果與分析

3.1 ITS2序列特征分析

本研究統計了38 個居群清風藤屬植物分子樣進行PCR 擴增后的擴增成功率和測序成功率。結果顯示，擴增成功率與測序成功率均為100%，表明本研究所選用的ITS2 序列引物在清風藤屬植物中的通用性好。測序所得的序列經拼接、去除引物區和低質量序列，剪切兩端5.8S和28S區，清風藤屬植物的ITS2序列長度均為241 bp，GC 含量為51.9-64.7%。保守位點168 個，變異位點數目為73 個，簡約信息位點數目為65 個。CpG、TpG（CpA）和 TpA 頻率為 20.75%（50/241），2倍簡并位點25個，4倍簡并位點39個（圖1）。

3.2 清風藤屬ITS2序列種內和種間變異分析

應用MEGA 7.0 軟件通過K2P 模型，統計清風藤屬種間和種內遺傳分化情況，獲得的ITS2序列的種內與種間變異值詳情見表2。ITS2 序列在清風藤屬中，種內變異為0-0.074，其中種內變異最大的為S.swinhoei（0.074±0.002），S.campanulata與S.fasciculate種內遺傳變異為0；種間變異在0.007-0. 205，其中S.discolor與S. swinhoei種間遺傳距離最大，為 0.205 ±0.007，S.campanulata與S.transarisanensia種間遺傳距離最小，為0.007?？傮w看，ITS2 序列在清風藤屬內種間遺傳距離與種內遺傳距離存在一定間隔，可將各種類進行區分，是清風藤屬植物較為理想的DNA條形碼候選序列。

3.3 清風藤屬ITS2序列系統進化樹構建

應用ML，自展支持率（bootstrap）1000 次重復檢驗進行系統進化樹構建（圖2）。由ITS2 系統進化樹可知：清風藤屬厚盤組Sect.Pachydiscus下的四川清風藤、鐘花清風藤亞種（鄂西清風藤）、云南清風藤、阿里山清風藤4 個種聚為1 支，組下的4 個種又各為單列，具有一定的遺傳距離，能夠較好的將清風藤屬2 個組區分。其中，廣布種四川清風藤由于采集地居群差異，具有較大的遺傳距離，貴陽居群與其余居群區分，這與遺傳距離分析結果一致。

清風藤組Sect.Sabia下的小花清風藤S.parviflora、簇花清風藤S. fasciculata樣品較好的各自聚為一支，可與其余種類較好的區分。平伐清風藤S.dielsii與灰背清風藤S.discolor聚成一支，且灰背清風藤S.discolor2 個樣品均鑲嵌于平伐清風藤S.dielsii中，不宜區分。尖葉清風藤S. swinhoei樣品均能聚為成一支，但各產地樣品變異較大，不能聚類。可見，小花清風藤、簇花清風藤、云南清風藤、鄂西清風藤較為保守；平伐清風藤與灰背清風藤親緣關系較近，但平伐清風藤與四川清風藤變異較為復雜。

4 討論

清風藤屬藥用植物以莖葉及根入藥，由于其特殊的藥用功效多數種類在其產地均為藥用，最早記載于宋代的《本草圖經》，后《本草綱目》及貴州、湖南、廣西等地的《天目山藥用植物志》、《廣西本草選編》等地方醫藥典籍與醫藥地方標準均有記載。又名“青藤、尋風藤”等，具有祛風利濕，活血解毒等功效。以小花清風藤藥用最為廣泛，在廣西、貴州、云南、湖南、湖北等地均有藥用，用于治療和預防黃疸型傳染性肝炎?，F代研究表明，清風藤屬植物具有良好的抗肝炎作用，有巨大的開發利用潛力。

目前，清風藤屬植物及其藥材的分類鑒定主要依賴于性狀鑒別，顯微方法等傳統方法。由于其特殊的結構特性、遺傳與分布特性，依靠標本難以對其進行分類鑒定，該屬植物系統分類與鑒定還有待完善，尤其在清風藤藥材的鑒定過程中應用傳統分方法更難以區分。本研究對9 種清風藤屬藥用植物38 個居群核基因片段ITS2序列的結構、種間遺傳距離與系統關系進行了分析。結果顯示，ITS2 序列在清風藤屬植物中的擴增率成功率與測序成功率均達到100%，引物通用性較好，較為容易得到質量較高的序列片段，具有較高的可行性。

表2 清風藤屬植物ITS2序列種內和種間平均遺傳距離

圖2 基于ITS2構建的清風藤屬藥用植物ML系統進化樹

分析獲得清風藤屬ITS2 序列保守位點168 個，變異位點數目73 個，簡約信息位點數目65 個；其中，二倍簡并位點25 個，四倍簡并位點39 個。表明，ITS2 序列在清風藤屬藥用植物中具有較好的進化速率與變異程度，種間變異位點豐富，且種內變異位點較少。

ITS2 序列在清風藤屬種內變異為0-0.074，種間變異為0.007-0.205，但從各種間遺傳距離看，種間遺傳距離均大于種內遺傳距離，具有較好的種間分離度。從ITS2 構建的系統發育樹結果看，在四川清風藤、尖葉清風藤、灰背清風藤等部分廣布種中，存在屬內種間遺傳距離與種內遺傳距離存在交叉，大多數種內具有穩定的遺傳，近地理居群親緣較近。系統樹基本符合傳統的系統分類學方法，清風藤組Sect.Sabia從清風藤屬中區分聚為一個大支，包括于厚盤組Sect.Pachydiscus中，傳統的分類方法將其單列，與清風藤組Sect.Sabia平行，有待進一步從基因組角度研究探討。種間聚類情況與遺傳距離分析結果一致，具有較好的種間分化。平伐清風藤為貴州特有植物，是典型的狹域分布種類，具有明顯的區域分布特征，系統關系分析中，平伐清風藤與灰背清風藤親緣關系較近，且平伐清風藤變異較為復雜，所有樣品不能更好聚類。這提示平伐清風藤在可能是一個雜交形成物種，但還需結合形態特征，從多序列或基因組的角度進一步深入研究，予以證實。

綜上，除平伐清風藤、灰背清風藤與廣布種四川清風藤外，ITS2 序列基本能將屬下物種進行區分。因此認為，ITS2 序列在清風藤屬植物中具有適宜的分化和保守性，能夠對種間進行較為準的分類和鑒別。研究中除阿里山清風藤外，均具有2個以上的產地樣品，進行了反復驗證，具有可重復性，符合清風藤屬藥用植物DNA條形碼鑒定要求。因此，本研究中的ITS2序列適用于清風藤屬藥用植物的分類鑒定和系統學分析。本研究豐富了清風藤屬藥用植物的分子生物學研究數據，為該屬植物的種類鑒定、物種起源、演化與系統學等研究提供了一定參考。