冬凌草甲素抑制人宮頸癌HeLa細胞生存、遷移、侵襲的活性研究＊

劉 藝，郭金興

（1. 牡丹江醫學院藥學院 牡丹江 157011；2. 牡丹江醫學院附屬紅旗醫院 牡丹江 157011）

宮頸癌（cervical carcinoma）是常見的威脅女性健康及生命的惡性腫瘤。國際癌癥研究中心研究數據表明，2013 年世界范圍內確診宮頸癌病例約48.5 萬，死亡23.6 萬[1]。我國宮頸癌統計學研究數據表明，2009 年，我國宮頸癌發病率為12.96/10 萬，死亡率為3.28/10萬[2]。宮頸癌95%的病例是由高危型人乳頭瘤病毒（HPV）持續感染引起，其他危險因素如早婚、結婚次數過多、丈夫包皮過長、性伴侶過多、多產及初產年齡過早、人工流產次數過多、口服避孕藥、吸煙與被動吸煙、機體免疫功能低下等[3-6]。目前宮頸癌的治療仍以傳統放化療為主，而放化療耐受已成為宮頸癌治療失敗、癌癥轉移和復發的主要原因之一[7]。近年來，中藥治療腫瘤以其多靶點、來源豐富、有效低毒的優勢日益收到大多學者高度的重視。冬凌草甲素（oridonin）是唇形科香茶菜屬植物冬凌草主要的抗癌有效成分，為貝殼杉烯類二萜。現代藥理研究表明，冬凌草甲素對多種腫瘤有治療作用如直腸癌[8]、前列腺癌[9]、乳腺癌[10]、肺癌[11]、肝癌[12]、食管癌[13]、卵巢癌[14]、胰腺癌[15]等，提示冬凌草甲素具有較好的抗腫瘤效果。也有研究表明，冬凌草甲素對人宮頸癌HeLa 細胞增殖具有明顯的抑制作用[16,17]。然而有關于冬凌草甲素對HeLa細胞遷移和侵襲能力的影響鮮見報道。故此本研究觀察了冬凌草甲素對HeLa 細胞遷移和侵襲能力及Wnt/β-連環蛋白（β-catenin）信號通路的影響，為其治療宮頸癌提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株

人宮頸癌HeLa細胞（美國ATCC，貨號：ZY-H066）接種于含10%熱滅活胎牛血清（foetal bovine serum，FBS）、2%谷氨酰胺、100 μg·mL-1鏈霉素和100 U·mL-1青霉素的RPMI-1640 培養液中培養。每48 h 更換新鮮培養液，待細胞融合度達80%時，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。

1.1.2 主要試劑

冬凌草甲素（純度＞99.4%，美國Amresco，貨號：28957-04-2）；二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO，美國 SIGMA，貨號：D5879-100ML）；RPMI-1640 培養基、FBS 和胰蛋白酶（美國 Gibco 公司，貨號：12633、DXT-10099141、X4380）；細胞計數試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）；（美國 Abbkine 公司，貨號：KTC011001）；TUNEL 細胞凋亡原位檢測試劑盒（美國Ambion 公司，貨號：xyG001-1）；Annexin V-FITC/PI 試劑盒（美國BD 公司，貨號：556547）；鼠抗人β-catenin單克隆抗體（美國Abcam 公司，貨號：xyKF682）；鼠抗人原癌基因（C-myc）單克隆抗體（美國Merck Millipore公司，貨號：DXT-ST257261）；鼠抗人細胞周期素D1（Cyclin D1）和兔抗人GAPDH 多克隆抗體（美國Bioss公司，貨號：bs-0623R-1，bs-0755R-1）；其它試劑均為進口或者國產分析純。

1.1.3 主要儀器

Model 311 型CO2培養箱（美國Thermo Scientific 公司）；Bio-Tek ELX800 型多功能酶標儀（美國Bio Rad公司）；FACS CaliburTM流式細胞儀（美國BD 公司）；BX43熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；Power PAC1000電泳儀（美國Bio Rad 公司）；Micropulser 電轉儀（美國Bio Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 藥物配制

冬凌草甲素溶于 DMSO 配制成 160 μmol·L-1儲備液，DMSO濃度≤0.1%且不誘導細胞增殖或者死亡。-20℃冰箱保存，臨用時以RPMI-1640 培養液稀釋到所需濃度。

1.2.2 CCK-8實驗

嚴格按照CCK-8 檢測試劑盒操作說明書進行HeLa細胞活力檢測。將對數生長期HeLa細胞接種于96孔板，細胞密度為1.5× 104個細胞/孔。37℃、5%CO2及飽和濕度下培養，待細胞貼壁后，實驗組分別加入含不同濃度為10、20、40、80、160 μmol·L-1冬凌草甲素的RPMI-1640培養液100 μL，對照組加入不含冬凌草甲素的RPMI-1640 培養液100 μL。每個劑量組均設6 個復孔。37℃、5% CO2及飽和濕度下培養。分別于12 h，24 h和36 h后終止培養，各孔均加入CCK-8試劑10 μL，混勻。37℃、5%CO2及飽和濕度下培養4 h。酶標儀檢測450 nm 處的吸光度（optical density，OD）值，以未加入HeLa 細胞，未加入冬凌草甲素，但是加入CCK-8 試劑的培養空作為空白組。計算細胞活力，細胞活力（%）=（實驗組的OD 值-空白組的OD 值）/對照組的OD 值-空白組的OD 值）× 100%，并應用Bliss 法計算半數抑制濃度（IC50）值。

1.2.3 細胞凋亡檢測

（1）TUNEL染色

嚴格按照TUNEL 凋亡檢測試劑盒操作說明書進行HeLa 細胞凋亡檢測。取潔凈無菌玻片置于24孔板底部，將對數生長期HeLa 細胞以密度為4 × 104個細胞/mL 接種于24 孔板。37℃、5%CO2及飽和濕度下培養，待細胞貼壁后，實驗組分別加入含不同濃度為10、20、40 μmol·L-1冬凌草甲素的 RPMI-1640 培養液 300 μL，對照組加入不含冬凌草甲素的RPMI-1640培養液300 μL。每個劑量組均設6 個復孔。37℃、5% CO2及飽和濕度下培養24 h 后終止培養，取出玻片，4%多聚甲醛于4℃下固定 30 min，3% H2O2封閉 10 min，0.1%的 Triton-100 置于冰上打孔 5 min，加 80 μL 的 TUNEL檢測液，37℃、5%CO2及飽和濕度下培養2 h，DAPI 染核5 min，50%甘油封片。熒光顯微鏡下觀察HeLa 細胞核熒光變化。結果判定：凋亡細胞核發出綠色熒光，未凋亡細胞核發出藍色熒光。隨機選取10個視野觀察，分別計數凋亡細胞數和總細胞數，計算凋亡指數。凋亡指數=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

（2）Annexin V-FITC/PI雙染法

嚴格按照AnnexinV-FITC/PI試劑盒操作說明書進行HeLa 細胞凋亡檢測。分組及細胞培養同“（1）”。0.25%胰蛋白酶消化，1200 r·min-1離心5 min，收集細胞，PBS洗滌2次，250 μL結合緩沖液重懸細胞（Binding Buffer），2000 r·min-1離心 5 min 后，去除上清液，添加100 μL Binding Buffer 并吹打，依次加入 Annexin VFITC 和 PI 液各 5 μL 混勻，室溫避光反應 15 min，再加入400 μL Binding Buffer，轉移至流式管，于1 h 內流式細胞儀檢測細胞凋亡，計算凋亡率。凋亡率（%）=Q2凋亡率+Q4凋亡率。

1.2.4 細胞粘附實驗

將分組及細胞培養同“（1）”。預處理過的HeLa細胞接種于預先用Matrigel 膠包被96 孔板。37℃、5%CO2及飽和濕度培養120 min。PBS 洗滌2 次去除未粘附的細胞，加入MTT 20μL，37℃、5%CO2及飽和濕度培養4 h，加DMSO 150 μL 溶解結晶顆粒，置搖床上低速振蕩10 min，酶標儀檢測450 nm 處的OD 值，計算粘附率。粘附率（%）=實驗組的OD/對照組的OD×100%。

1.2.5 劃痕修復實驗

將對數生長期HeLa 細胞以密度為4×104個細胞/mL接種于6孔板，37℃、5%CO2及飽和濕度下培養，待細胞平鋪面積達80%后，用已消毒的10 μL 槍頭垂直劃一條泳道，PBS 洗去脫落細胞。分組及細胞培養同“（1）”。倒置顯微鏡下拍照，用NIH image J 軟件計算劃痕面積，計算遷移率。遷移率（%）=實驗組劃痕面積/對照組劃痕面積×100%。

1.2.6 Transwell小室體外侵襲實驗

將Transwell 侵襲小室進行Matrigel 膠鋪膠，置于恒溫培養箱中進行固化處理。用無血清培養液將HeLa 細胞饑餓培養24 h 后，在上層小室加入200 μL密度為4 × 104個細胞/mL 細胞懸液，而在下室中加入完全培養基。分組及細胞培養同“（1）”。取出小室，棄上層小室培養液，PBS 洗滌3 次，無菌棉簽擦去未侵襲細胞，結晶紫染色，倒置顯微鏡下計數穿過的細胞總數，計算侵襲率。侵襲率（%）=實驗組侵襲細胞數/對照組侵襲細胞數×100%。

1.2.7 Western blot分析

分組及細胞培養同“（1）”。1200 r·min-1離心 5 min，收集細胞，充分裂解后提取總蛋白，用BCA 法測定蛋白濃度。在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺預制凝膠中，各培養孔加入50 μg 蛋白樣品進行電泳。常規轉膜后5%脫脂奶粉封閉2 h。分別與Ⅰ抗鼠抗人β-catenin 單克隆抗體，鼠抗人C-myc 單克隆抗體，鼠抗人Cyclin D1 4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，洗膜后加辣根過氧化酶標記山羊抗兔Ⅱ抗，37℃、5% CO2及飽和濕度下孵育1 h。TBST 洗膜3 次，ECL 顯影。以GAPDH作為內參。Gel-pro 4.0軟件進行分蛋白條帶與GAPDH灰度比值，計算相對表達量。

圖1 不同濃度冬凌草甲素對HeLa細胞增殖的影響

1.3 統計分析

采用SPSS 18.0 統計軟件進行。數據分析計量資料采用“”表示，各組數據符合正態分布，方差齊時，采用單因素方差分析，組間兩兩比較，采用LDS 檢驗；方差不齊時采用 Games-Howell 檢驗。P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 冬凌草甲素對HeLa細胞增殖的影響

HeLa細胞經不同濃度0、10、20、40、80、160 μmol·L-1冬凌草甲素處理 12 h，24 h 和 36 h 后，以 CCK-8 檢測細胞活力。結果顯示，冬凌草甲素對HeLa 細胞增殖具有明顯的抑制作用，且隨著作用時間和作用濃度的增加，抑制作用逐漸增加（圖1）。當冬凌草甲素濃度為 80 μmol·L-1處理24 h 時，HeLa 細胞活力約為 50%。24 h，48 h 和 72 h 的IC50分別為（151.36 ± 18.72）μmol·L-1，（62.10 ± 7.39）μmol·L-1和（8.41 ± 1.07）μmol·L-1。本研究后續實驗采用 ≤80 μmol·L-（110、20、40 μmol·L-1）冬凌草甲素及24 h作為實驗濃度和處理時間。

2.2 冬凌草甲素對HeLa細胞凋亡的影響

2.2.1 TUNEL染色結果

與對照組比較，10、20、40 μmol·L-1冬凌草甲素組HeLa 細胞凋亡指數顯著升高（P＜ 0.05，P＜ 0.01）（圖2、圖3）。

2.2.2 Annexin V-FITC/PI雙染法結果

與對照組比較，10、20、40 μmol·L-1冬凌草甲素組HeLa 細胞凋亡率顯著升高（P＜ 0.05，P＜ 0.01）（圖4、圖5）。

2.3 冬凌草甲素對HeLa細胞粘附力的影響

與對照組比較，10、20、40 μmol·L-1冬凌草甲素組HeLa細胞粘附率顯著降低（P＜ 0.05，P＜ 0.01）（圖6）。

2.4 冬凌草甲素對HeLa細胞遷移能力的影響

與對照組比較，10、20、40 μmol·L-1冬凌草甲素組HeLa 細胞遷移率顯著降低（P＜ 0.05，P＜ 0.01）（圖7、圖8）。

2.5 冬凌草甲素對HeLa細胞侵襲能力的影響

與對照組比較，10、20、40 μmol·L-1冬凌草甲素組HeLa 細胞侵襲率顯著降低（P＜ 0.05，P＜ 0.01）（圖9、圖10）。

2.6 冬凌草甲素對HeLa細胞侵Wnt/β-catenin信號通的影響

與對照組比較，10、20、40 μmol·L-1冬凌草甲素組HeLa 細胞β-catenin、C-myc 和 Cyclin D1 蛋白表達均顯著降低（P＜ 0.05，P＜ 0.01）（圖11、圖12）。

3 討論

本研究CCK-8 結果顯示，冬凌草甲素可呈劑量-時間依賴效應的方式抑制HeLa 細胞增殖。同時本研究TUNEL 染色和Annexin V-FITC/PI 雙染法結果顯示，冬凌草甲素亦可誘導HeLa 細胞凋亡。以上研究結果與文獻報道相一致[18]。

遷移和侵襲是惡性腫瘤轉移和浸潤的重要過程，遷移和侵襲能力越強說明腫瘤細胞運動能力越強，腫瘤越容易轉移和浸潤[19]。轉移和浸潤是一個受多種因素調控的復雜過程，除了與腫瘤細胞新生血管的形成有關以外，亦與細胞的粘附力，遷移和侵襲能力的改變有關，為惡性腫瘤治療失敗及預后較差的主要原因[20]。本研究通過細胞粘附實驗檢測了冬凌草甲素對HeLa細胞粘附力的影響，劃痕修復實驗檢測了冬凌草甲素對HeLa細胞侵襲能力的影響，Transwell小室體外侵襲實驗檢測了冬凌草甲素對HeLa細胞侵襲能力的影響。結果顯示，冬凌草甲素顯著抑制HeLa 細胞粘附力，遷移和侵襲能力，且隨著藥物濃度增加，抑制作用逐漸增加。這些結果提示，冬凌草甲素除了可以抑制HeLa細胞增殖和誘導其凋亡以外，亦可通過抑制其遷移和侵襲能力共同發揮抗宮頸癌作用。

圖2 TUNEL染色結果（×200）

圖3 冬凌草甲素對HeLa細胞凋亡指數的影響

圖4 Annexin V-FITC/PI雙染法結果

圖5 冬凌草甲素對HeLa細胞凋亡率的影響

圖6 冬凌草甲素對HeLa細胞粘附率的影響

圖7 劃痕修復實驗結果（×40）

圖8 冬凌草甲素對HeLa細胞遷率的影響

圖9 Transwell小室體外侵襲實驗結果（結晶紫，×200）

圖10 冬凌草甲素對HeLa細胞侵襲率的影響

宮頸癌細胞遷移和侵襲是制約其療效、影響預后及的重要因素之一。惡性腫瘤細胞的轉移和浸潤是一個由多種分子參與調節的復雜過程。Wnt/β-catenin信號通路是細胞內重要信號通路，與惡性腫瘤有著密切的關系，參與多個生物學進程調控（如調控細胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等），其異常活化參與人類多種癌癥的發病過程[21]。β-catenin 是 Wnt/β-catenin 信號通路關鍵的信號轉導分子，是該信號通路激活的標志[22]。β-catenin表達量越高，腫瘤的惡性程度越高，遷移和侵襲能力越強，預后也越差[23]。當Wnt/β-catenin信號通路異常激活時，β-catenin 在細胞質中降解減少，去磷酸化并進入細胞核，進而開啟下游C-myc 和Cyclin D1 等靶基因的異常表達，從而促進腫瘤細胞的增殖，轉移和侵襲[24]。研究表明，宮頸癌患者及HeLa細胞β-catenin 表達異常[25,26]。本研究 western blot 分析結果顯示，冬凌草甲素顯著降低HeLa 細胞β-catenin、C-myc 和Cyclin D1 表達。以上結果提示，冬凌草甲素可抑制Wnt/β-catenin信號通路。

圖11 Western blot結果

圖12 冬凌草甲素對HeLa細胞Wnt/β-catenin信號通的影響

綜上所述，冬凌草甲素具有抑制HeLa 細胞增殖的作用，亦可誘導凋亡及抑制遷移和侵襲能力，并抑制Wnt/β-catenin 信號通路。目前對于冬凌草甲素的抗宮頸癌作用仍不明確，今后的實驗中還需要具體探討。