基于網(wǎng)絡(luò)藥理學方法探討八珍湯治療ITP的作用機制＊

姜云耀，劉 楠，胡曉梅，侯金才，劉建勛＊＊

（1. 清華大學藥學院中藥研究院 北京 100084；2. 北京盈科瑞藥物安全有效性研究有限公司 北京 102206；3. 中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院 北京 100091；4. 京津冀聯(lián)創(chuàng)藥物研究（北京）有限公司 北京 100083）

原發(fā)免疫性血小板減少癥（Primary immune thrombocytopenia，ITP）以前又被稱為“特發(fā)性血小板減少性紫癜”。導(dǎo)致血小板減少的原因有很多，機體對自身血小板抗原免疫失耐受是主要原因之一，也是ITP 發(fā)生的主要原因。骨髓巨核細胞成熟障礙是ITP發(fā)生的最常見表現(xiàn)，臨床上也多表現(xiàn)出皮膚、黏膜、內(nèi)臟出血等癥狀，嚴重時可以直接危及到生命。目前，西方醫(yī)學尚未發(fā)現(xiàn)十分有效的ITP 治療方法，現(xiàn)有方法十分局限，且伴有較大的副作用。中醫(yī)藥治療ITP具有獨特優(yōu)勢，因此應(yīng)當加快相關(guān)研究進展。中藥八珍湯由人參、當歸、茯苓、甘草、川芎、白術(shù)、熟地黃、白芍8味藥材組成，具有益氣補血的功效，主治氣血兩虛證，在臨床上主要用于氣不攝血型ITP 的治療。金小洣[1]發(fā)現(xiàn)以益氣補血、養(yǎng)陰生精、涼血止血為法治療ITP 療效顯著，并用加味八珍湯治愈ITP，愈后隨訪未見復(fù)發(fā)。文鴻光等[2]以加味八珍湯聯(lián)合小劑量醋酸潑尼松片的方法治療ITP，明顯提高了患者血小板計數(shù)，顯著提高了臨床療效，并改善患者的生活質(zhì)量。熊春琦[3]用八珍湯加味聯(lián)合激素成功治愈了36 例ITP 患者。八珍湯既有補氣又有補血的功效，研究表明八珍湯治療ITP 與抑制血小板聚集、增強機體造血功能和調(diào)節(jié)免疫功能等密切相關(guān)。但目前尚未有八珍湯治療ITP作用機制的相關(guān)報道。

中藥方劑在中國具有數(shù)千年的應(yīng)用歷史，是中醫(yī)整體觀的體現(xiàn)，具有配伍的特點。隨著近年來對中藥方劑研究的不斷深入，其復(fù)雜的化學體系與機體復(fù)雜生物系統(tǒng)的相互作用成為當前研究的重要課題[4]。生物網(wǎng)絡(luò)及多靶點的干預(yù)方法符合中藥方劑的作用特點，運用網(wǎng)絡(luò)與系統(tǒng)的思想有助于對方劑復(fù)雜的化學體系和作用機制進行理解。因此，從生物網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的角度揭示中藥方劑的作用奧秘，既符合中藥作用的整體理論，又符合中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的研究思路[5]。為了從系統(tǒng)角度和分子水平闡明中藥，研究者建立了“網(wǎng)絡(luò)靶標，多成分”模式的中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，預(yù)測中藥的靶點和藥理作用，解釋中藥方劑的配伍規(guī)則和網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)作用[6]。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法從分子水平上闡述八珍湯化學成分與成分之間、成分與靶點之間、靶點與疾病之間的潛在聯(lián)系，探索成分、靶點、蛋白質(zhì)和疾病之間的相互作用關(guān)系[7]，從而探討八珍湯治療ITP的作用機制，為進一步明確ITP 的發(fā)生機制及八珍湯治療ITP的相關(guān)機理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）[8]；Drugbank 數(shù)據(jù)庫（https://www.drugbank.ca/）[9]；Cytoscape 3.7.1 軟 件[10]；OMIM 數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man）；TTD 數(shù)據(jù)庫（Therapeutic Targets Database）[11]；GAD 數(shù) 據(jù) 庫（Genetic Association Database）；GeneCards 數(shù)據(jù)庫[12]；STRING 數(shù)據(jù)庫 ；DAVID 數(shù)據(jù)庫（Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）[13]；KEGG 數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）[14]；Omicshare。

2 方法

2.1 八珍湯化學成分篩選和靶點預(yù)測

中藥八珍湯由人參、熟地黃、當歸、甘草、川芎、白術(shù)、白芍、茯苓8 味藥組成。參照劉楠等[15]的方法，通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫和國內(nèi)外文獻研究收集上述8 味中藥的主要化學成分，同時設(shè)定口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）等相關(guān)參數(shù)對收集到的八珍湯的主要化學成分進行篩選。根據(jù)文獻報道，參數(shù)設(shè)定條件為OB ≥30%和DL ≥0.18[16]，篩選符合條件的化學成分，既而選取來源于Drugbank 數(shù)據(jù)庫的化學成分作用靶點信息，同時剔除非人源靶點。一些化合物如益母草苷、梓醇、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯I等雖然不滿足篩選條件，但是通過查閱文獻可知這些化合物在治療ITP 方面具有相關(guān)活性，所以將這些不滿足篩選條件的化合物也一并作為候選成分納入分析[17]。在設(shè)定OB、DL 作為篩選條件的基礎(chǔ)上又通過文獻查找的方式收集八珍湯化學成分，使得結(jié)果更全面。

2.2 ITP相關(guān)靶點獲取

ITP 的英文名稱有 primary immune thrombocytopenia、idiopathic thrombocytopenic purpura、immune thrombocytopenic purpura 和 primary thrombocytopenic purpura。因此，以上述英文名稱為關(guān)鍵詞分別在OMIM數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫、GAD數(shù)據(jù)庫和GeneCards數(shù)據(jù)庫查找ITP的相關(guān)靶點。

2.3 八珍湯治療ITP的相關(guān)靶點獲取

為了闡述八珍湯治療ITP 的作用機制，本文將八珍湯的作用靶點與預(yù)測得到的ITP 作用靶點進行合并取其交集，共有靶點即認為是八珍湯治療ITP 的相關(guān)靶點。然后將獲取的靶點上傳到STRING 數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，分析核心靶點。

2.4 八珍湯治療ITP的相關(guān)靶點富集分析

本文利用Cytoscape 3.7.1 軟件中的ClueGO 插件對八珍湯治療ITP 的相關(guān)靶點進行基因本體（GO）富集分析，選擇生物過程（biological process），設(shè)置P≤0.01。通過DAVID 在線分析工具實現(xiàn)對靶點的KEGG生物通路富集分析。通過KEGG數(shù)據(jù)尋找富集出來的生物通路，借助Omicshare獲取的KEGG生物通路富集分析結(jié)果繪制成氣泡圖。

3 結(jié)果

3.1 八珍湯化學成分的收集與篩選

利用 TCMSP 數(shù)據(jù)庫，以 OB ≥30% 和 DL ≥ 0.18 為篩選條件從八珍湯各組成藥味中收集到了160個化合物。其中甘草的化學成分最多，有92個；人參次之，有22 個成分；茯苓有15 個成分；白芍有13 個成分；白術(shù)有7個成分；川芎有7個成分；當歸有2個成分；熟地黃有2 個成分。除上述成分之外，基于文獻研究我們了解到還有9 個化學成分具有廣泛藥理活性，但因不滿足OB 和DL 的篩選條件未被納入，此次也將它們作為候選化合物納入研究。例如阿魏酸在血小板聚集和血栓形成等方面具有顯著效果，同時還表現(xiàn)出了抗氧化、抗炎以及免疫調(diào)節(jié)等作用[18]。藁本內(nèi)酯在抗炎和免疫調(diào)節(jié)等方面也表現(xiàn)出了很好的藥理作用[19]。因此，共篩選得到169個八珍湯所含的化學成分，其中白芍 14 個、人參 23 個、甘草 92 個、茯苓 15 個、白術(shù) 7 個、川芎7 個、當歸6 個、熟地黃5 個。刪除重復(fù)后共獲得159個成分。

3.2 靶點預(yù)測

利用TCMSP 分析平臺，對從八珍湯中篩選出的159 個化合物進行來源于Drugbank 數(shù)據(jù)庫的靶點預(yù)測，其中芍藥苷、黃甘草苷、苯甲酰芍藥苷等28個化合物在該數(shù)據(jù)庫中沒有靶點。總共獲得了八珍湯中131個化合物的靶點，靶點總數(shù)為1823 個。其中，白芍99個、人參 204 個、甘草 1272 個、茯苓 28 個、白術(shù) 20 個、川芎36 個、當歸106 個、熟地黃58 個。去除重復(fù)后總共得到146個靶點。

3.3 成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

以八珍湯中篩選出的化合物和靶點為基礎(chǔ)建立成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）。該網(wǎng)絡(luò)包含277 個節(jié)點和1823條邊，131個化合物的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度中位數(shù)為11，表明大多數(shù)化合物影響多個靶點。其中山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇和槲皮素的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度分別為118、87、84和70，它們在網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置。因此，山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇和槲皮素可能是八珍湯關(guān)鍵的多效活性成分。

3.4 ITP相關(guān)靶點

以ITP 各英文名稱為關(guān)鍵詞分別在OMIM 數(shù)據(jù)庫、TTD 數(shù)據(jù)庫、GAD 數(shù)據(jù)庫和 GeneCards 數(shù)據(jù)庫中進行搜索，在OMIM 數(shù)據(jù)庫中查找到6 個ITP 相關(guān)靶點，在 TTD 數(shù)據(jù)庫中查找到 4 個 ITP 相關(guān)靶點，在 GAD 數(shù)據(jù)庫中查找到18 個ITP 相關(guān)靶點，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中查找到303 個ITP 相關(guān)靶點，刪除重復(fù)后總共得到306個ITP相關(guān)靶點（圖2）。

圖1 八珍湯的成分-預(yù)測靶點網(wǎng)絡(luò)

3.5 八珍湯治療ITP的相關(guān)靶點

將八珍湯的作用靶點與預(yù)測得到的ITP 作用靶點進行合并取其交集后共獲得21個靶點，分別為BCL2、CCL2、F3、F7、HMGCR、IFNG、IGHG1、IL1B、IL2、IL6、KDR、MPO、NOS3、NR3C1、PLAT、PPARG、PTGS2、PTGS2、SELE、THBD、TNF、VEGFA（圖3）。

3.6 八珍湯治療ITP相關(guān)靶點的富集分析

為了進一步闡述八珍湯治療ITP 的作用機制，本文利用Cytoscape 3.7.1 軟件中的ClueGO 插件對八珍湯治療ITP 的相關(guān)靶點進行生物過程的富集分析。以P＜0.01 為條件進行篩選，富集到114 個生物過程（圖4）。圖中每個圓點都代表一個生物過程，用圓點大小表示P值的大小，圓點越大說明P值越小。其中positive regulation of vitamin metabolic process、positive regulation of endocytosis、regulation of endothelial cell proliferation、positive regulation of leukocyte cell-cell adhesion 和response to glucocorticoid 富集程度顯著。應(yīng)用DAVID 分析工具對相關(guān)靶點進行KEGG 富集分析，篩選得到P＜0.05 的 KEGG 通路 34 條，選擇前 20 條通路構(gòu)建氣泡圖（圖5）。圖中圓點的顏色和大小反映了與通路相關(guān)聯(lián)的基因數(shù)量及P值，P值越小顏色越偏于紅色，相關(guān)聯(lián)基因的數(shù)量越多圓點則越大。結(jié)果顯示，八珍湯治療ITP 的機制主要涉及TNF signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、NOD-like receptor signaling pathway 和 VEGF signaling pathway 等 通 路 。八珍湯治療ITP 相關(guān)靶點的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖6）中紅色的點為TNF信號通路相關(guān)的靶點。

4 討論

圖2 ITP相關(guān)靶點網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 八珍湯治療ITP候選靶點的GO富集

ITP 是最常見的自身免疫性血細胞減少癥，其特征在于短暫或持續(xù)減少的血小板計數(shù)[20,21]。ITP 的發(fā)生源于抗血小板自身抗體的產(chǎn)生導(dǎo)致網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)特別是脾中的血小板破壞[22]。ITP患者伴有瘀傷，皮膚出血和不常發(fā)生的嚴重出血（包括顱內(nèi)出血）[23]。此外，ITP 患者的生活質(zhì)量因身體癥狀、心理癥狀、恐懼、社交活動減少和工作能力下降而惡化[24]。新診斷的ITP 患者的標準療法是止血和通過藥物增加血小板計數(shù)，但這些藥物往往具有嚴重的副作用[25]。考慮到高昂的治療費用，ITP 患者將面臨巨大的經(jīng)濟負擔，特別是患有嚴重疾病的患者[26]。從中醫(yī)理論解釋，ITP是一種因脾不統(tǒng)血而引起血溢脈外的疾病，臨床表現(xiàn)為血熱妄行、氣不攝血、陽虛火旺、瘀血阻絡(luò)等，治療方法一般包括清熱涼血、健脾益氣、滋陰清熱、活血通絡(luò)等[27]。八珍湯、歸脾湯等中藥是中醫(yī)臨床治療ITP 的常用方劑。八珍湯具有氣血雙補的功效，研究表明八珍湯具有抑制血小板聚集、增強機體造血功能的作用，并可以通過調(diào)節(jié)免疫功能發(fā)揮治療ITP的作用[28]。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法探討八珍湯治療ITP的可能作用機制。首先通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和文獻報道從八珍湯配伍中藥人參、茯苓、白術(shù)、甘草、當歸、川芎、白芍和熟地黃中總共篩選出159 個化學成分進行靶點預(yù)測分析，總共得到146 個靶點。TCMSP 數(shù)據(jù)庫是中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學研究中常用的工具之一，其獨特優(yōu)勢在于可通過ADME 參數(shù)對中草藥所含化學成分進行篩選，提高結(jié)果的準確性。但也有一定的局限性，如在以O(shè)B 和DL 為條件進行成分篩選時，一些被納入的成分在治療相關(guān)疾病方面可能不具有相關(guān)活性，而還有一些具有相關(guān)藥理作用的成分由于不滿足篩選條件而沒有被納入，這時就應(yīng)該通過查閱文獻的方式手動將這些成分納入。在本研究中阿魏酸、藁本內(nèi)酯等9個化合物即為具有相關(guān)藥理活性但不滿足篩選條件而手動納入的成分。在八珍湯的作用靶點分析中，雖然預(yù)測得到的各化學成分靶點數(shù)量不同，但有些成分靶點的重疊程度卻很大，也就是說八珍湯中的各成分具有共同或相似的靶點，起到協(xié)同增效的作用。在成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，八珍湯的131個化合物的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度中位數(shù)為11，說明大多數(shù)化合物都具有多重靶點。其中山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇和槲皮素的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度最高，它們在網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置。因此，它們可能是八珍湯關(guān)鍵的多效活性成分。

圖5 八珍湯治療ITP候選靶點的KEGG通路富集

圖6 八珍湯治療ITP相關(guān)靶點的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

為了揭示八珍湯治療ITP 的作用機制，將八珍湯作用靶點與ITP 相關(guān)靶點進行合并取其交集，即為八珍湯治療ITP 的相關(guān)靶點。通過對八珍湯治療ITP 相關(guān)靶點的基因功能和KEGG 生物通路的富集分析，得到八珍湯治療ITP相關(guān)靶點主要涉及的生物過程和相關(guān)生物通路的信息。八珍湯治療ITP主要涉及內(nèi)吞作用的正調(diào)控、內(nèi)皮細胞增殖的調(diào)控、白細胞粘附的正調(diào)控、維生素代謝過程的正調(diào)控和糖皮質(zhì)激素的應(yīng)答等生物過程，在生物通路方面主要包括TNF 信號通路、NOD 樣受體信號通路、HIF-1 信號通路、VEGF 信號通路等。此外，單純性皰疹感染、麻疹、Toll 樣受體信號通路、T 細胞受體信號通路等也被顯著富集。盧檸[29]的研究發(fā)現(xiàn)，ITP 患者外周血中的TNF-α明顯高于正常組，在經(jīng)過治療后TNF-α顯著下降，說明TNF-α參與了ITP 的發(fā)病機制。據(jù)文獻報道，皰疹類病毒、麻疹病毒、肝炎病毒、人類微小病毒B19 等也與ITP 的發(fā)生具有密切關(guān)聯(lián)[30]。王藝超等[31]對ITP 患者和正常人的脾巨噬細胞通過高通量基因芯片技術(shù)進行基因表達的分析，并對患者的差異表達基因進行生物通路分析，研究結(jié)果顯示Toll 樣受體信號通路、T 細胞受體通路等為主要通路。張雪皎[32]通過對ITP 患者細胞因子的研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子信號通路JAK-STAT 信號通路、Toll 樣受體信號通路、MAPK 信號通路的改變與疾病的發(fā)生有關(guān)。徐顏美[33]對漢族人群ITP 患者進行了全基因組關(guān)聯(lián)的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)JAK-STAT信號通路、癌癥通路等與ITP 的發(fā)生有關(guān)。隨濤等[34]通過篩選ITP 患者血漿差異microRNA，并對靶基因進行富集分析發(fā)現(xiàn)，ITP 與鈣離子信號通路、MAPK 信號通路、GnRH 信號通路等密切相關(guān)。曾艷等[35]通過對比研究ITP 患者和健康人Treg 細胞microRNA 的表達，發(fā)現(xiàn)ITP 與MAPK 信號通路、代謝通路、鈣離子信號通路和T 細胞受體通路等相關(guān)。在八珍湯治療ITP 相關(guān)靶點的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中，TNF、IL6、SELE、CCL2、IL1B 和PTGS2 這6 個TNF 信號通路相關(guān)靶點在網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置，說明TNF 信號通路可能是八珍湯治療ITP的關(guān)鍵機制。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法研究八珍湯治療ITP 的作用機制，發(fā)現(xiàn)八珍湯可能通過內(nèi)吞作用的正調(diào)控、內(nèi)皮細胞增殖的調(diào)控、白細胞粘附的正調(diào)控、維生素代謝過程的正調(diào)控和糖皮質(zhì)激素的應(yīng)答等生物過程發(fā)揮治療ITP 的作用；其作用機制可能與TNF 信號通路、NOD 樣受體信號通路、HIF-1 信號通路、Toll樣受體信號通路癌癥通路、T 細胞受體信號通路和VEGF 信號通路等有關(guān)，其中TNF 信號通路可能是八珍湯治療ITP 的關(guān)鍵機制。在八珍湯眾多化學成分之中，山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇和槲皮素可能是其發(fā)揮治療ITP作用的關(guān)鍵多效活性成分。