基于網(wǎng)絡藥理學探析復方麥孜彼子口服液治療慢性非細菌性前列腺炎的作用機制＊

吉米麗汗·司馬依，買買提明·努爾買買提，艾尼瓦爾·吾買爾，季志紅，阿地力江·薩吾提，買爾旦·玉蘇甫，周文婷＊＊

（1. 新疆醫(yī)科大學藥學院藥理學教研室 烏魯木齊 830011；2. 新疆醫(yī)科大學維吾爾醫(yī)學院 烏魯木齊 830011；3. 新奇康藥業(yè)股份有限公司 烏魯木齊 830011）

慢性非細菌性前列腺炎（Chronic Abacterial Prostatitis，CAP）是多種復雜的原因和誘因引起的炎癥、免疫、神經(jīng)內(nèi)分泌參與的錯綜的病理變化，又稱為慢性骨盆疼痛綜合征（Chronic Pelvic Pain Syndronmes，CPPS），導致以尿道刺激癥狀和慢性盆腔疼痛為主要臨床表現(xiàn)。有國內(nèi)報道稱[1]，慢性前列腺炎（Chronic Prostatitis，CP）在 30-40 歲和 61-70 歲之間男性中的發(fā)病率為6.0%-32.9%，發(fā)病率近35%。其中，90%以上為CAP。目前，床上對其病程的不同，使用抗生素，適當輔助給予α-受體阻滯劑、肌肉松馳劑、抗氧化劑、激素類等藥物。此類藥物雖然會減輕相關的癥狀，但是會導致小便頻數(shù)、余瀝不盡、腰膝酸軟、頭暈目眩、寐差耳鳴、早泄夢遺等不良現(xiàn)象，不宜長期使用。中藥現(xiàn)代研究結(jié)果顯示，中藥對其效果明顯，不僅減少相應的癥狀，還減輕疼痛，副作用少[2-4]。治療CAP 的中藥不僅具有抗炎和抗感染，還有改善微循環(huán)、免疫調(diào)節(jié)和調(diào)節(jié)前列腺液pH 環(huán)境等特點[5]，會增強機體細胞和體液免疫功能，從而達到抵御炎癥因子入侵的作用[6-8]。

西帕依麥孜彼子口服液（Xipayimaizibizi Liquid，XmL）是中醫(yī)學（維醫(yī)方向）臨床常用、代表性的治療CAP 的經(jīng)典復方，由桑椹、芡實、金櫻子和梔子等4 味中藥組成，其具有抗炎，改善微循環(huán)、免疫調(diào)節(jié)的功效，還能夠有效地減輕疼痛不適的癥狀。朱翠玲等[9]研究，桑葚提取物抑制炎癥相關因子表達量，產(chǎn)生炎性免疫反應，從而減弱促炎癥反應，發(fā)揮抗炎功效。樊修和等[10]研究，芡實正丁醇部位分離組分具有對H2O2 誘導的PC12（神經(jīng)細胞株）細胞有神經(jīng)保護作用。已有研究表明[11]，梔子苷能抑制細胞的免疫應答，同時能明顯降低細胞中TNF-α、IL-1β、前列腺素的含量，在對神經(jīng)系統(tǒng)炎癥治療中發(fā)揮著積極作用。劉相文等[12]研究表明，金櫻子多糖的提取物對各類病毒感染的治療具有獨特的藥物作用優(yōu)勢。

綜上可以看出XmL 的4 味草藥的共同功效是防御病原體的感染、調(diào)節(jié)免疫以及神經(jīng)分泌功能。XmL本藥也有已研究的報道，如XmL聯(lián)合甲磺酸多沙唑嗪緩釋片的綜合治療方法更能有效地減輕患者排尿不暢、疼痛不適等癥狀，耐受性較好，其可能成為臨床治療CAP 有效的中西醫(yī)結(jié)合治療方案，值得在臨床治療上大力推廣和應用[13]。遺憾的是，目前XmL 的抗炎、抗感染，改善微循環(huán)、免疫調(diào)節(jié)、前列腺液作用機制尚未系統(tǒng)的描述。本文通過網(wǎng)絡藥理學系統(tǒng)的描述XmL的作用機制，為今后的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫進行DL和OB篩選

將成分根據(jù)ADME 的類藥性（Drug-likeness, DL）和藥物口服生物利用度（Oral bioavailability,OB）等參數(shù)篩選了入血活性成分。其中DL 是指與良好的臨床療效相關聯(lián)的物理化學性質(zhì)（如溶解性、穩(wěn)定性等）及生物學特性（即吸收、分布、代謝、排泄和毒性（ADMETox））[14-18]。OB 是指制劑中藥物被吸收進入人體循環(huán)的速度與程度。本研究選取DL ≥0.18、OB ≥30 的化合物進行進一步研究。

其中A 是給定草藥成分的分子描述，B 代表該性質(zhì)在Drugbank 數(shù)據(jù)庫（https://www.drugbank.ca/）中所有分子的平均值。

表1 XMB“復方-成分-靶點”基本信息

1.2 候選化合物和候選靶點的篩選

候選化合物和候選靶點的篩選：通過Cytoscape3.6.0 軟件構建候選化合物-候選靶點網(wǎng)絡圖，按照Degree和Betweenness的大小順序再進一步篩選化合物和靶點。

1.3 潛在靶點的篩選

潛在靶點的篩選：①通過TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫并結(jié)合已報道CP 發(fā)病機制相關文獻挖掘出其相關的靶點。②通過CTD（http://ctdbase.org/）數(shù) 據(jù) 庫“Urogenital disease（male）”中“Proteinuria”“Homo sapiens”為關鍵詞篩選出 CAP 相關的潛在靶點。

1.4 GeneMANIA 基因分析

GeneMANIA 基因分析，即 GeneMANIA（http://genemania.org/）數(shù)據(jù)庫“Homo sapiens”為關鍵詞下載全部基因進行分析基因的功能、基因表達和優(yōu)先基因排序等[19]各基因之間相互關系。

1.5 通路分析與網(wǎng)絡構建

將潛在基因?qū)肷飳W信息注釋數(shù)據(jù)庫DAVID6.8（https://david.ncifcrf.gov/）通 過 基 因 本 體（Gene Ontology,GO）生物過程和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）對靶點進行代謝通路富集分析。最后，使用Cytoscape 3.6.0 軟件構建復方-潛在化合物-潛在靶點-通路網(wǎng)絡圖。

2 結(jié)果

2.1 活性成分的篩選結(jié)果

將TCMSP數(shù)據(jù)庫和已報道的文獻中找出的XmL中4味草藥的263個化合物和4511個靶點通過OB和DL方法篩選得到24個化合物和1002個靶點。（見表1、表2）

2.2 候選成分-候選靶點預測結(jié)果

將24個化合物和1002個靶點通過Cytoscape 3.6.0軟件的Degree 和Betweenness 參數(shù)的大小順序篩選出前10 個候選化合物和候選靶點（表3、表4），構建復方-候選化合物-候選靶點網(wǎng)絡圖（Herb-potential compounds-potential targets network，HB-pC-pT）（圖1）。

表2 XmL中活性成分的OB和DL篩選結(jié)果表

2.3 潛在化合物-潛在靶點的預測結(jié)果

將 1002 個靶點按 Degree ≥ 5 篩選出的 72 個靶點和 24 個化合物導入 CTD 數(shù)據(jù)庫，“Urogenital disease（male）”中“Proteinuria”“Homo sapiens”為關鍵詞篩選出10 個潛在化合物和其對應的57 個CAP 特異性靶蛋白，并進行了靶向研究。

2.4 基因分析結(jié)果

GeneMANIA 分析結(jié)果顯示，57 個靶點相互作用中，各基因之間的Co-expression 是42.27%、Physical Interaction是28.10%。（圖2）

2.5 通路分析與網(wǎng)絡構建

GO 分析結(jié)果為57 個潛在基因涉及到生物過程（biological process） biological regulation、metabolicprocess、cellular process 等127 個；分子功能（molecular function）catalytic activity、binding、molecular transducer activity 等 78 個；細胞組分（cellular component）：cell、mambrace、organelle 等 58 個；通路（Pathway）：CCKR 信號通路、促性腺激素釋放激素受體途徑細胞凋亡信號通路等164 個信號通路等（圖3）。通過DAVID 數(shù)據(jù)庫（P≤ 0.05）進行通路分析（表5）。結(jié)果表明，57個潛在靶點參與的主要通路為PI3K-Akt信號通路、TNF 信號通路 MAPK 和 AMPK 信號通路、NF-κB 信號通路、HIF-1信號通路、Toll樣信號通路和P53信號通路等與人體識別病原體，產(chǎn)生免疫反應有關的信號通路。甲狀腺激素信號通路、雌激素信號轉(zhuǎn)導通路、血清素能突觸、膽堿能突觸、心肌細胞中的腎上腺素信號和唾液分泌等與神經(jīng)，內(nèi)分泌密切相關的信號通路。而色氨酸代謝和鈣信號通路等人體的代謝密切相關的信號通路。最后，通過Cytoscape 3.6.0 軟件構建復方-潛在化合物-潛在靶點-通路網(wǎng)絡圖(圖4)。

表3 根據(jù)Degree和Bentweenness篩選XmL的前10個候選化合物

表4 根據(jù)Degree和Bentwenness篩選XMB的前10個候選基因

圖1 復方-候選化合物-候選靶點網(wǎng)絡圖

圖2 利用GeneMANIA分析潛在靶點網(wǎng)絡

圖3 Go分析：分子功能（1），細胞組分（2），生物過程（3），信號通路（4）

表5 潛在靶點的KEGG通路富集分析（P ≤0.05）

3 討論

DL 是指與良好的臨床療效相關聯(lián)的物理化學性質(zhì)（如溶解性、穩(wěn)定性等）和生物學特性（即吸收、分布、代謝、排泄和毒性（ADME-Tox））。DL 越大，則成藥性越高。以系統(tǒng)藥理學方法來分析傳統(tǒng)中醫(yī)藥時，DL ≥0.18 為篩選生物活性成分的標準。OB 是指制劑中藥物被吸收進入人體循環(huán)的速度與程度。反映所給藥物進入人體循環(huán)的藥量比例，OB 描述口服藥物由胃腸道吸收，及經(jīng)過肝臟而到達體循環(huán)血液中的藥量占口服劑量的百分比，OB ≥30 為篩選生物活性成分的標準[20-21]。如表2所示，4味草藥中有24個化合物符合DL 和OB 的標準，并且4 味草藥的化學成分中均存在槲皮素（Quercetin）。槲皮素[22]通過 NF-κB 和MAPK信號通路對大鼠CAP有保護作用。金櫻子與芡實中的β-谷甾醇和芡實中豆甾醇具有抗雄激素的作用，抑制巨噬細胞的遷移和巨噬細胞介導的基質(zhì)細胞增殖而發(fā)揮治療CAP的作用[23]。

圖4 復方-潛在化合物-潛在靶點-通路網(wǎng)絡圖

24 個化學成分通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫整理相應的靶點，使用 Cytoscape 3.6.0 軟件 Degree 和 Betweenness 參數(shù)[24]，進行刻畫網(wǎng)絡節(jié)點的程度分析并篩選前十個候選化合物和候選靶點（表3、表4）。候選靶點篩選結(jié)果分 別 為 ：PTGS2、PTGS1、NCOA2、HSP90AA1、PRKACA、DPP4、BCL2、JUN、CASP3 和PPARG 等候選靶點（Degree ≥9）。候選化合物篩選結(jié)果為槲皮素（Degree = 154、Betweenness = 0.1830）帕列最前，其次山奈酚（Kaempferol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、甘露醇（Mandenol）、β-胡蘿卜素（Beta-carotene）、桑色素（morin）、藏花酸（crocetin）、蘇丹3（Sudan III）、3-甲基山奈酚（3-Methylkempferol）和豆甾醇（Stigmasterol）等10 候選化合物。其中前5個化合物是4味中草藥共有的成分〔圖1（1）和圖1（2）〕，推測5個化合物為XmL的主要候選化合物。然后，此5 個候選化合物和對應的靶點再通過Cytoscpe3.6.0 軟件構建網(wǎng)絡圖〔圖1（3）〕。按Degree 來表示候選靶蛋白圓形的大小，Degree 越大圓形半徑越大，關聯(lián)的化合物數(shù)量就越多。其中能與候選化合物關聯(lián)度大于2 的靶蛋白有PTGS2、BCL2、JUN、CASP3、PTGS1、CASP9、CYP1A2、AKT1 、HMOX1和GABRA1等候選靶蛋白。此10個靶點與上述10 個候選靶點均有PTGS2、BCL2 、JUN、CASP3 和PTGS1等靶蛋白。推測此5個靶點為XmL的主要候選靶蛋白。

XmL 的 24 個成分和 Degree ≥ 5（72 個靶點）的靶蛋白通過CTD 數(shù)據(jù)庫篩選結(jié)果為XmL 的10 個潛在化合物及其對應的57個CAP特異性靶蛋白，并進行了靶向研究（見圖5）。10個潛在化合物分別為：槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、β-胡羅卜素、維生素E、花青素、異歐前胡素、藏花酸、豆甾醇和桑色素等潛在化合物。將57 個潛在靶蛋白通過GeneMANIA 數(shù)據(jù)庫分析各基因之間的關系（見圖3）。結(jié)果提示了這些化合物的變化會對XMB 治療CAP 的成分-靶點網(wǎng)絡穩(wěn)定性和完整性產(chǎn)生較大影響，從而改變其治療CAP 的療效。其中的有些潛在靶點已有文獻報道，如劉穎等[25]研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ 治療 CAP 可以通過抑制 NF-κB 的活化來抑制炎癥和免疫反應；王龍等[26]研究發(fā)現(xiàn)，前列腺炎的炎癥可通過上調(diào)Bcl-2 蛋白參與其對CAP細胞凋亡的調(diào)節(jié)和也可能通過影響CASP3 激活參與抑制CAP 細胞凋亡。這些研究結(jié)果充分說明，XmL 的各成分和相應的基因之間在治療CAP中相輔相成，協(xié)同發(fā)揮作用。

GO 和KEGG 通路分析中作為Pathway 注釋分類的主要公共數(shù)據(jù)庫。表5 顯示為57 個靶點參與了18個主要信號通路（P≤0.05），信號通路網(wǎng)絡可以看出第三排的10 個信號通路，即PI3K-Akt 信號通路（Counted gene = 10）、TNF 信號通路（Counted gene =7）、MAPK 信號通路（Counted gene= 7）、AMPK 信號通路（Counted gene = 5）、NF-κB 信號通路（Counted gene = 4）、HIF-1 信號通路（Counted gene = 5）、Toll 樣信號通路（Counted gene = 5）、P53 信號通路（Counted gene = 5）、VEGF 信號通路（Counted gene = 4）和cGMP-PKG 信號通路（Counted gene = 5）等與人體識別病原體，產(chǎn)生免疫反應有關的信號通路。第二排的信號通路是甲狀腺激素信號通路（Counted gene= 7）、雌激素信號通路（Counted gene = 6）、血清素能突觸（Counted gene=6）、膽堿能突觸（Counted gene=6）、心肌細胞中的腎上腺素信號通路（Counted gene = 5）和唾液分泌信號通路（Counted gene = 4）等與神經(jīng)，內(nèi)分泌密切相關的信號通路。而第一排的信號通路為色氨酸代謝（Counted gene = 3）和鈣信號通路（Counted gene=6）等人體的代謝密切相關的信號通路。有關上述信號通路已有研究報道，如槲皮素通過NF-κB 和MAPK信號通路對大鼠CAP有保護作用，王強等[27]研究發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK 信號通路在治療CAP 中起著重要作用。除了這些信號通路意外，還涉及癌癥有關的信號通路。結(jié)果顯示，XmL能夠從神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫，代謝等方面參與人體防御病原體入侵，而發(fā)揮治療CAP作用。

4 結(jié)論

本研究通過DL 和OB 方法合并，應用CTD 數(shù)據(jù)庫篩選復方麥孜彼子口服液中4 味草藥的10 種活性化合物，由18個主要信號通路中的57個潛在靶點發(fā)揮其治療慢性非細菌性前列腺炎的作用，體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點協(xié)同作用的特點。從網(wǎng)絡角度，本研究提供了復方麥孜彼子口服液治療慢性非細菌性前列腺炎潛在靶點的系統(tǒng)觀點，需要進一步的實驗來驗證。