疏肝健脾法對2型糖尿病小鼠胰島素抵抗的影響＊

賈曉蕾，王 磊，秦靈靈，呂翠巖，張程斐，劉銅華＊＊

（1. 北京中醫藥大學第三附屬醫院 北京 100029；2. 北京中醫藥大學 北京 100029；3. 首都醫科大學附屬北京中醫醫院 北京 100069）

近些年，我國糖尿病發病率大為增加，而今已經成為全球當之無愧的糖尿病高發病率國家[1]。2 型糖尿病是糖尿病發病患者中占絕大多數的類型。2 型糖尿病病人中有近四分之一的人存在胰島素抵抗，胰島素抵抗成為2型糖尿病患病的主要發生進展的因素之一。多種糖尿病代謝并發癥的發展也在在胰島素抵抗的基礎上開始的[2]。現代醫學治療胰島素抵抗主要是使用有一定副作用的二甲雙胍、噻唑烷二酮類等。祖國傳統醫學在胰島素抵抗相關方面治療進行了大量的研究，應用中醫藥干預胰島素抵抗，恰能填補當前西藥治療之空白。精神狀態出現異常能夠增加胰島素抵抗和糖尿病發病風險[3]。中醫疏肝健脾法能夠改善糖尿病相關癥狀并具有一定的降糖作用，并已有一定的臨床文獻基礎。中醫《傷寒論》經典方劑四逆散及《丹溪心法》中的痛瀉要方是其中的代表。但其作用能否改善胰島素抵抗、防止或延緩糖尿病的發生、發展，尚缺乏相關臨床和實驗研究。由此，不妨做出假設：從“治未病”角度來講，中醫疏肝健脾法可能能夠防止或延緩糖尿病的發病和進展[4]。中醫疏肝健脾法能夠改善糖尿病相關癥狀并具有一定的降糖作用，我們需要從“治未病”角度進一步探索疏肝健脾法預防和治療2 型糖尿病的作用機制，選方四逆散及痛瀉要方合劑，通過對患者胰島素相關指標等水平的測定，探索疏肝健脾法對2 型糖尿病及胰島素抵抗的調控作用。

表1 第4周末KK-Ay小鼠28天空腹血糖變化（n = 6）

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗選用無特定病原體級實驗動物（SPF級）雄性KK-Ay 小鼠24 只（6-7 周齡），對照組選用SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠6 只（6-7 周齡），實驗動物采用單籠喂養。

動物來源北京華阜康生物科技股份有限公司；實驗動物許可證號：SYXK（京）2019-0022。

1.2 藥物與試劑

四逆散及痛瀉要方合劑（由柴胡6 g、枳實6 g、芍藥6 g、甘草6 g、陳皮6 g、防風3 g、白術6 g組成），北京康仁堂有限公司生產配方顆粒；鹽酸二甲雙胍片（批號：ABF2569 規格0.5 g/片）,中美上海施貴寶制藥有限公司；高脂飼料，北京華阜康生物科技股份有限公司；胰島素ELISA 試劑盒，公司：abcam，批號：GR313414-1。美國強生全血糖儀及配套試紙。

1.3 儀器

酶標儀（Multiskan MK3 型，Thermo 制造）；低溫高速離心機（3κ30，美國Sigma 公司制造）；水浴鍋（榮華儀器廠）；高效液相色譜儀（上海精科/儀電上分LC-210型）。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及飼養方法

選取兩次血糖值≥13.9 mmol·L-1（非同日隨機血糖）的6-7周齡KK-Ay小鼠24只，隨機分成模型組、二甲雙胍組、中藥高劑量組、中藥低劑量組。正常組選擇6 只6-7 周齡C57BL/6J 小鼠作為正常組入組。C57BL/6J 小鼠給與普通飼料喂養，KK-Ay 小鼠給與KK 高脂鼠料(鼠料含有58%脂肪，25.6%碳水化合物，16.4%蛋白質)。各組小鼠皆適應性喂養1周。

1.4.2 給藥

每天以灌胃方式給藥。給藥劑量：鹽酸二甲雙胍片 35 mg·kg-1·d-1（按成人劑量 2500 mg·70 kg-1·d-1換算）；中藥高劑量組（5.52 g·kg-1·d-1），中藥低劑量組（1.84 g·Kg-1·d-1）；中藥劑量以生藥計，均根據相關文獻結合臨床最大成人劑量得出。模型組和空白組予同劑量的生理鹽水。各組均按0.1 ml·10 g-1·d-1給藥（但不超過0.8 ml）。連續給藥4周。

1.4.3 檢測方法

（1）空腹血糖

剪尾取血，用血糖儀進行檢測。

（2）口服葡萄糖耐量實驗（OGTT）

給藥第3 周，小鼠禁食不禁水12 h，50%葡萄糖2 g·kg-1灌胃，尾靜脈取血，測定0,30,60,120 min 血糖，計算曲線下面積（AUC）=0.5*(Bg 0 min+Bg 30 min)/2+ 0.5*(Bg 30 min + Bg 60 min)/2 + 1*(Bg 60 min + Bg 120 min)/2。

（3）空腹血清胰島素水平測定（Fins）及胰島素敏感指數測定

空腹血清胰島素水平測定采用放射免疫法測定。胰島素敏感指數HOMA-IS = 1/HOMA-IR = 22.5（/空腹血糖水平（FPG，mmol·L-1）× 空腹胰島素水平（FINS，mIU·L-1））

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 四逆散及痛瀉要方合劑對KK-Ay 小鼠空腹血糖的影響

第4周末，與正常組比較，模型組空腹血糖呈逐漸升高趨勢，存在明顯的空腹血糖異常（P＜0.01）。二甲雙胍組、中藥低劑量組、中藥高低量組皆對血糖有控制作用（P＜0.05）。二甲雙胍組作用優于中藥高劑量組（P＜0.01）。這說明四逆散及痛瀉要方合劑可對KK-Ay 小鼠空腹血糖有降低作用，但是四逆散及痛瀉要方合劑的作用并不優于二甲雙胍（表1）。

表2 第3周末KK-Ay小鼠OGTT、AUC的變化

第4周末空腹血糖：正常組非正態分布，進行非參數檢驗。模型組與正常組相比較P＜0.01，組間有差異。與模型組比較，中藥低劑量組P＜0.05，二甲雙胍組、中藥高劑量組與模型組比較P皆小于0.01;與二甲雙胍組比較，二甲雙胍組和高劑量組皆有顯著性差異P＜ 0.01。

2.2 四逆散及痛瀉要方合劑對KK-Ay 小鼠OGTT、AUC的影響

第3 周末模型組較正常組AUC 明顯升高（P＜0.01），二甲雙胍組、中藥低、高劑量組較模型組都可明顯降低AUC（P＜0.01）。這說明四逆散及痛瀉要方合劑可調節KK-Ay小鼠葡萄糖耐量，降低胰島素抵抗指數（表2）。

2.3 四逆散及痛瀉要方合劑對KK-Ay 小鼠空腹血清胰島素的影響

與正常組相比較，模型組空腹胰島素水平明顯升高（P＜ 0.01）；與模型組相比較，二甲雙胍組P＜ 0.01，低劑量和高劑量組P＜0.05；與二甲雙胍組比較，低劑量組P＜0.01,高劑量組P＜0.05。這說明四逆散及痛瀉要方合劑可降低KK-Ay 小鼠胰島素血清水平（表3）。

表3 第4周末KK-Ay小鼠空腹血清胰島素水平

2.4 四逆散及痛瀉要方合劑對KK-Ay 小鼠胰島素敏感指數的影響

與正常組相比，模型組胰島素敏感指數降低（P＜0.01）;與模型組比較，二甲雙胍組胰島素敏感指數降低P＜ 0.01，中藥高劑量組P＜ 0.05，中藥低劑量組P＞0.05。這說明四逆散及痛瀉要方合劑可提高KK-Ay小鼠胰島素敏感指數（表4）。

表4 第4周末KK-Ay小鼠胰島素敏感指數

3 討論

胰島素抵抗（IR）是指一種病理狀態，在該狀態下，正常濃度的胰島素產生的靶組織（例如肝臟，肌肉和脂肪組織）細胞的水平低于相應的生物學效應[5]。環境與遺傳因素往往相互影響，最終可以導致胰島素抵抗。在胰島素抵抗的情況下，隨著時間的流逝，胰島β 細胞代償性分泌增加會導致β 細胞衰竭，導致血糖控制不佳，從而導致2 型糖尿病[6]。因此，胰島素抵抗是導致2型糖尿病發生和發展以及各種代謝關聯疾病（如糖耐量降低，高血壓，中樞性肥胖，血脂異常和動脈粥樣硬化）發生的主要因素之一[7]。由胰島素抵抗和相關代謝紊亂引起的一系列疾病統稱為胰島素抵抗綜合征（IRS）或代謝綜合征（MS）。IDF 將胰島素抵抗和胰島素抵抗綜合癥（代謝綜合癥）視為21 世紀世界面臨的主要健康問題之一[8]。因此，對胰島素抵抗的全面，詳細的研究對于2 型糖尿病及其相關并發癥的預防和治療具有重要的理論和實踐意義。

在現代社會中，人們的社交節奏不斷加快，生活，工作和研究壓力很大，甚至長期持續出現緊張，焦慮等情緒。精神因素在糖尿病及其并發癥中的重要作用最近幾年得到醫學界的認可[9]。西醫干預胰島素抵抗以二甲雙胍、噻唑烷二酮類為主，但是作為胰島素增敏劑的羅格列酮因為升高心血管事件風險已經禁用，吡格列酮亦被發現可能增加罹患膀胱癌風險而面臨下架危險[10]。因此，那么，可以使用那些西藥來改善胰島素抵抗以及葡萄糖和脂類代謝？情況不容樂觀。二甲雙胍目前在糖尿病預防指南中被用作一線藥物，并在臨床實踐中被廣泛使用。但其胃腸道不良反應令不少患者難以耐受，最終停藥。這極大限制了臨床上針對胰島素抵抗的治療。

在藥理研究中發現，降糖機理通過單味中藥及其復方都可體現，歸納起來可以通過以下多種途徑：①減少胰島素拮抗物。如降低胰高血糖素等；②動態調整糖原合成及分解；③增加糖酵解，提高外周細胞組織對血清葡萄糖的利用率；④增加胰島素受體數量和親和力，減輕受體缺乏癥；⑤目標組織細胞對胰島素敏感并有反應，從而降低受體后抵抗力。以上充分顯示了中藥干預胰島素抵抗多位點、多層次、多途徑及多效應的優勢[11]。

胰島素抵抗是現代醫學發展的新詞匯，其當屬中醫學“消渴”“消癉”等范疇[12]。中醫認為臟腑功能虛弱是其發生的內在因素，以肝脾腎最為重要；而飲食、情志、運動、房勞等是為外在因素。而情志因素在當今時代表現的愈發明顯。來自于生活工作學習等方面巨大的壓力，造成人們緊張焦慮、壓抑、甚至憤懣，通常頭痛、失眠、便秘、月經不調等癥狀伴隨出現。長期的慢性刺激或壓力事件會導致患者焦慮或壓力大，并且無法緩解容易導致肝郁的癥狀[13]。“心境愁郁，內火自燃，乃消癥大病”，這句話的意思是精神或情志是為肝所主的，從肝治療糖尿病是有相關理論依據的。有研究表明，焦慮癥狀在糖尿病患者中很常見，由肝功能疏泄失常引起消渴，再由消渴反過來影響肝功能，這兩者往往互為因果[14]。糖尿病患者從西醫上來說往往是出現胰島素絕對或相對不足，引起出現胰島素抵抗現象，從中醫來看是脾主運化，轉運五谷后天之氣能力較前降低，氣血津液停滯、郁、瘀、痰、濕等互結，發為消渴[15]。

本研究中選用中醫《傷寒論》經典方劑四逆散及《丹溪心法》中的痛瀉要方合方，柴胡、枳實、芍藥、甘草、陳皮、防風、白術組成。四逆散具有具有調和肝脾，透邪解郁，疏肝理脾之功效，痛瀉要方具有調和肝脾，補脾柔肝之功效。二方合用，共奏調和肝脾，柔肝理脾之效。方中柴胡為君，以奏疏肝解郁，升清陽之效，從而得使郁熱得解外透；白芍為臣，功效為養血斂陰，郁熱解而陰不傷與柴胡一升一斂相配；佐以枳實以為行氣，可以使氣機舒暢；炙甘草為使，甘溫緩急，調和諸藥。白術燥濕健脾，陳皮理氣醒脾。是為疏肝健脾法的常用處方。

本實驗采用自發性糖尿病KK-Ay 小鼠研究疏肝健脾法對糖尿病抵抗的影響，實驗期間自發性糖尿病KK-Ay 小鼠空腹血糖顯著升高，OGTT 出現異常，血清胰島素分泌水平增加，胰島素敏感指數降低。西藥對照采用了二甲雙胍，二甲雙胍可明顯降低自發性糖尿病KK-Ay 小鼠空腹血糖、調節KK-Ay 小鼠OGTT 中血糖水平，降低空腹血清胰島素水平及提高胰島素敏感指數。中藥采用了疏肝健脾法中的代表方四逆散及痛瀉要方合劑，實驗結果證明中藥高劑量組能夠降低自發性糖尿病KK-Ay 小鼠空腹血糖，調節KK-Ay 小鼠OGTT 中血糖水平，降低空腹血清胰島素水平及提高胰島素敏感指數，但效果并不優于西藥對照二甲雙胍，但是仍然可以說明中藥也有確切的療效，可以達到降低自發性糖尿病KK-Ay小鼠血糖水平，改善糖耐量異常，提高胰島素敏感性，從而能夠進一步減輕減緩胰島素抵抗的作用。