黃花草總黃酮超聲輔助提取工藝優化及抗氧化活性研究

許建本 蘇秀芳 黃妹膠

(1. 廣西民族師范學院化學化工學院，廣西 崇左 532200；2. 廣西高校桂西南特色植物資源化學重點實驗室培育基地，廣西 崇左 532200)

黃花草是山柑科藥用植物，主要分布在熱帶及亞熱帶地區，在中國云南、廣西和福建等地都有種植[1]，其種子可入藥、榨油，鮮葉可用于治療眼病[2]。目前有關黃花草的研究主要集中于藥用價值及重金屬脅迫下種子萌發等方面，如Parimaladevi等[3]研究了黃花草提取物對老鼠的止痛作用機制，周鑫磊[4]研究了Mn2+對黃花草種子萌發、幼苗生長等的影響及脅迫生理生化特征的變化，而關于黃花草有效成分及抗氧化方面的研究鮮見報道。黃酮類成分是普遍存在于植物體中的一種天然抗氧化劑，具有抗氧化[5]、抑菌[6]和抗病毒[7]等藥理作用。目前提取植物體中總黃酮的常見方法有溶劑浸提法、酶輔助提取法和超聲輔助提取法等，其中超聲輔助提取法因具有簡單、安全、高效等優點而備受關注[8]。

試驗擬以黃花草為原料，采用超聲輔助法提取黃花草中的總黃酮，優化其提取工藝條件，并研究黃花草總黃酮對·OH、DPPH·和亞硝酸鹽的清除能力，以期為黃花草的研究及開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

黃花草：摘自廣西崇左市江州區市政府公園，經廣西民族師范學院黃秋蟬教授鑒定為山柑科植物黃花草(CleomeviscosaL.)；

蘆丁標準品：生化試劑，上海晶純試劑有限公司；

無水對氨基苯磺酸：分析純，天津市光復精細化工研究所；

鹽酸萘乙二胺：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：≥97.0%，阿拉丁公司；

氫氧化鈉：分析純，廣東光華科技股份有限公司；

95%乙醇、30%過氧化氫、亞硝酸鈉、硝酸鋁、水楊酸、七水合硫酸亞鐵等：分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.1.2 主要儀器設備

高速萬能粉碎機：FW100型，天津市泰斯特儀器有限公司；

電子天平：JA1003N，上海精密科學儀器有限公司；

循環水式真空泵：SHZ-D(Ⅲ)型，鞏義市予華儀器有限責任公司；

可見分光光度計：7200型，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；

超聲波清洗器：SG2200HPT型，上海冠特超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黃花草的預處理工藝流程

黃花草洗凈→電熱鼓風干燥箱烘干(60 ℃)→粉碎→過篩(60目)→脫脂脫色(石油醚中浸泡、攪拌)→抽濾→烘箱干燥(50 ℃)→避光保存備用

1.2.2 黃花草總黃酮的提取 取1.000 0 g黃花草粉末，加入一定量乙醇溶液，充分混勻，設定提取功率，在一定溫度下超聲提取至指定時間，過濾，將濾液定容至50 mL容量瓶中，搖勻備用。

1.2.3 蘆丁標準曲線的繪制 根據文獻[9]，修改如下：先用70%(體積分數，下同)乙醇溶液配制0.2 mg/mL的蘆丁標準溶液，再準確吸取0.0，0.6，1.2，1.8，2.4，3.0 mL 0.2 mg/mL蘆丁標準溶液置于比色管中，用70%乙醇溶液定容，搖勻備用。吸取1.0 mL標準溶液于10 mL的比色管中，加入0.3 mL 5%的亞硝酸鈉溶液搖勻，靜置6 min；隨后加入0.3 mL 10%的硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min；再加入4.0 mL 4% 氫氧化鈉溶液，然后用70%乙醇溶液定容至10 mL，搖勻后放置反應15 min，以70%乙醇溶液作為空白，于510 nm處測定溶液吸光度。以蘆丁標準溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到標準曲線方程為：A=10.882x-0.000 2，R2=0.999 7，說明在此濃度范圍內，吸光度與蘆丁標準品的濃度具有較好線性關系。

1.2.4 單因素試驗設計

(1) 乙醇濃度：取1.000 0 g黃花草粉末，按料液比1∶20 (g/mL)分別與30%，40%，50%，60%，70%的乙醇混合，提取功率30 W，在60 ℃下超聲提取20 min，分析乙醇濃度對總黃酮得率的影響。

(2) 料液比：取1.000 0 g黃花草粉末，分別按料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 (g/mL)與50%乙醇混合，提取功率30 W，在60 ℃下超聲提取20 min，分析料液比對總黃酮得率的影響。

(3) 提取功率：取1.000 0 g黃花草粉末，按料液比1∶15 (g/mL)與50%乙醇混合，提取功率分別為30，40，50，60，70 W，在60 ℃下超聲提取20 min，分析提取功率對總黃酮得率的影響。

(4) 提取溫度：取1.000 0 g黃花草粉末，按料液比1∶15 (g/mL)與50%乙醇混合，提取功率分別為40 W，分別在30，40，50，60，70 ℃下超聲提取20 min，分析提取溫度對總黃酮得率的影響。

(5) 超聲時間：取1.000 0 g黃花草粉末，按料液比1∶15 (g/mL)與50%乙醇混合，提取功率分別為40 W，在50 ℃下分別超聲提取20，30，40，50，60 min，分析超聲時間對總黃酮得率的影響。

1.2.5 正交試驗設計 在單因素試驗基礎上，以對總黃酮得率影響較大的4個因素設計L9(3)4正交試驗，以黃花草總黃酮得率為評價指標，優化黃花草總黃酮提取工藝。

1.2.6 黃花草總黃酮得率的測定 吸取1.0 mL樣品液于10 mL比色管中，按“1.2.3”方法測定吸光度，再根據式(1)計算總黃酮得率。

(1)

式中：

C——總黃酮得率，%；

m——黃花草提取液的質量濃度，mg/mL；

V——樣品定容體積，mL；

N——稀釋倍數；

M——黃花草干粉質量，mg。

1.2.7 黃花草總黃酮抗氧化活性測定

(1) 對羥基自由基(·OH)清除能力的測定：根據文獻[10]，修改如下：分別在10 mL比色管中加入1 mL不同濃度(0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mg/mL)的黃花草總黃酮提取液，再加入2 mL 9 mmol/L FeSO4溶液，搖勻，然后加入2 mL 9 mmol/L水楊酸—乙醇溶液，充分搖勻，最后加入2 mL 8.8 mmol/ L H2O2，搖勻。靜置30 min后，在510 nm處測定吸光度，VC作為陽性對照。對照組以蒸餾水代替H2O2。空白組以蒸餾水代替黃花草總黃酮提取液。按式(2)計算·OH清除率。

(2)

式中：

K1——·OH清除率，%；

A1——樣品組吸光度；

A2——對照組吸光度；

A3——空白組吸光度。

(2) 對DPPH自由基(DPPH·)清除能力的測定：參照文獻[11]。

(3) 對亞硝酸鹽清除能力的測定：根據文獻[12]，修改如下：分別在10 mL比色管中加入2 mL不同濃度(0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mg/mL)的黃花草總黃酮提取液，再加入5 mL pH 3.0的檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖液，1 mL 100 μg/mL 亞硝酸鈉溶液，將混合物置于37 ℃的恒溫水浴鍋中1 h，取出，立即加入2 mL 4 mg/mL對氨基苯磺酸，搖勻，靜置5 min，再加入1 mL 2 mg/mL鹽酸萘乙二胺，用蒸餾水定容，搖勻，靜置15 min后，在540 nm 處測定吸光度，VC作為陽性對照。空白組以蒸餾水代替黃花草總黃酮提取液。按式(3)計算亞硝酸鹽清除率。

(3)

式中：

K2——亞硝酸鹽清除率，%；

A——樣品組吸光度；

A0——空白組吸光度。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excle (Office 2010)、Origin 8.5軟件進行數據處理及分析。所有試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度對黃花草總黃酮得率的影響 從圖1可以看出，適當提高乙醇濃度，總黃酮得率增大。這是因為隨著乙醇濃度增大，溶劑與黃酮類成分的極性越來越接近，黃花草細胞發生溶脹現象，有利于總黃酮溶出。當乙醇濃度為50%時，黃花草總黃酮得率達到最大。繼續增加乙醇濃度，溶劑與黃酮類成分的極性差異增大，影響了黃酮類成分的溶解性[13]，而且黃花草中醇溶性雜質大量溶出，這些雜質與黃酮類成分競爭溶劑，導致總黃酮得率減小。因此，選擇最佳乙醇濃度為50%。

圖1 乙醇濃度對黃花草總黃酮得率的影響

Figure 1 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids fromCleomeviscosa

2.1.2 料液比對黃花草總黃酮得率的影響 從圖2可以看出，隨著料液比增大，黃花草總黃酮得率先增大后減小。這是因為在一個合適的料液比范圍內，增加溶劑，黃花草細胞內總黃酮和溶劑的濃度差增大，加大了傳質效率，有利于總黃酮溶出[14]，因此，總黃酮得率增大。當料液比為1∶15 (g/mL)時，總黃酮得率最大。繼續增加料液比，溶劑量過大，超聲輔助效果減小，還會加大非黃酮類成分的溶出，導致總黃酮得率減小[15]。因此，選擇最佳料液比為1∶15 (g/mL)。

圖2 料液比對黃花草總黃酮得率的影響

Figure 2 Effect of material-to-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids fromCleomeviscosa

2.1.3 提取功率對黃花草總黃酮得率的影響 從圖3可以看出，提取功率在30～40 W范圍時，黃花草總黃酮得率隨著功率增大而增大。這是因為超聲波具有機械波動作用和空化效應[16]，適當增加超聲波功率，可以提高對黃花草細胞壁的破壞效果，有利于總黃酮溶出。當超聲波功率為40 W時，總黃酮得率最大。繼續增加功率，黃酮類成分結構被過強的超聲波破壞，總黃酮得率下降。因此，選擇最佳提取功率為40 W。

2.1.4 提取溫度對黃花草總黃酮得率的影響 從圖4可以看出，黃花草總黃酮得率隨著溫度升高呈先增大后減小的趨勢，50 ℃時提取率達到最大。這是因為適當升高溫度可以增加分子動能，加快分子運動，增強總黃酮的滲透擴散能力，使得總黃酮得率增大。當提取溫度高于50 ℃ 時，部分不穩定黃酮類成分的結構被破壞，且在高溫下乙醇易揮發，導致溶劑濃度降低，不利于總黃酮溶出[17]，使得總黃酮得率下降。綜合考慮，選擇最佳提取溫度為50 ℃。

圖3 提取功率對黃花草總黃酮得率的影響

Figure 3 Effect of extraction power on extraction yield of total flavonoids fromCleomeviscosa

圖4 提取溫度對黃花草總黃酮得率的影響

Figure 4 Effect of extraction temperature on extraction yield of total flavonoids fromCleomeviscosa

2.1.5 超聲時間對黃花草總黃酮得率的影響 從圖5可以看出，隨著超聲時間的延長，黃花草總黃酮得率先增大后減小。這是因為在20～50 min內，黃花草細胞壁逐漸被破壞，總黃酮從開始溶出至全部溶出，所以總黃酮得率逐漸增大。再繼續延長時間，長時間地加熱和超聲會使溶出的總黃酮被氧化或分解，導致總黃酮得率下降。因此，選擇最佳提取時間為50 min。

圖5 超聲時間對黃花草總黃酮得率的影響

Figure 5 Effect of ultrasonic time on extraction yield of total flavonoids fromCleomeviscosa

2.2 正交試驗

在單因素試驗基礎上，以料液比、乙醇濃度、提取功率和超聲時間4個條件為考察因素，設計正交試驗。提取溫度取50 ℃，試驗因素水平取值見表1，試驗結果見表2。

表1 因素水平表

表2 正交試驗結果

從表2可以看出，各因素對黃花草總黃酮得率的影響順序為D>B>C>A，即：超聲時間>乙醇濃度>提取功率>料液比。最佳提取工藝組合為A2B2C2D2，即料液比為1∶15 (g/mL)，乙醇濃度為50%，提取功率為40 W，超聲時間為50 min。經3次平行實驗驗證，得到黃花草總黃酮得率為(2.711±0.002)%，說明通過正交試驗得到的最佳工藝條件穩定性和重現性較好。

2.3 加標回收試驗

取1.0 mL最佳提取條件下得到的黃花草提取液3份，分別加入到3個10 mL比色管中，再在各比色管中分別加入1.0 mL 0.200 0 mg/mL的蘆丁標準溶液，搖勻，靜置15 min后按“1.2.3”方法測定吸光度，得到回收率的均值為99.58%，RSD=0.78%，說明該方法準確可靠，可用于黃花草總黃酮得率的測定。

2.4 黃花草總黃酮的抗氧化性

2.4.1 黃花草總黃酮對·OH的清除能力 由圖6可知，隨著濃度增加，黃花草總黃酮和VC對·OH的清除率均增大。當黃花草總黃酮的濃度為0.25 mg/mL時，對·OH 的清除率達到(52.48±0.88)%，說明黃花草總黃酮對·OH具有一定清除能力，但作用效果弱于VC。

圖6 不同質量濃度樣品對·OH的清除效果

2.4.2 黃花草總黃酮對DPPH·的清除能力 從圖7可以看出，在濃度為0.05～0.25 mg/mL時，黃花草總黃酮和VC對DPPH·均具有較強的清除能力。當濃度為0.05 mg/mL 時，VC對DPPH·的清除率為(95.25±0.43)%，繼續增加濃度，清除率無明顯變化。黃花草總黃酮對DPPH·的清除率隨著濃度的增大而增大，當其濃度為0.25 mg/mL時，對DPPH·的清除率達到(95.58±0.28)%，清除能力接近VC，說明黃花草總黃酮對DPPH·具有很好的清除效果。

圖7 不同質量濃度樣品對DPPH·的清除效果

2.4.3 黃花草總黃酮對亞硝酸鹽的清除能力 從圖8可以看出，當濃度為0.05，0.10 mg/mL時，黃花草總黃酮對亞硝酸鹽的清除能力強于VC，繼續增大濃度，黃花草總黃酮對亞硝酸鹽的清除能力弱于VC。當濃度為0.25 mg/mL 時，黃花草總黃酮和VC對亞硝酸鹽的清除率分別為(57.27±0.15)%，(85.59±0.21)%，說明黃花草總黃酮對亞硝酸鹽具有一定的清除能力，但弱于VC。

圖8 不同質量濃度樣品對亞硝酸鹽的清除效果

3 結論

試驗表明，黃花草總黃酮的最佳提取工藝為料液比1∶15 (g/mL)，乙醇濃度50%，提取功率40 W，超聲時間50 min，提取溫度50 ℃，此條件下得到黃花草總黃酮得率為(2.711±0.002)%。在考察的濃度范圍內，黃花草的抗氧化能力隨總黃酮濃度增加而增強，當總黃酮濃度為0.25 mg/mL時，對·OH、DPPH·和亞硝酸鹽的清除率分別為(52.48±0.88)%，(95.58±0.28)%，(57.27±0.15)%。黃花草中的總黃酮是一種活性較好的抗氧化劑。試驗僅研究了黃花草總黃酮的超聲輔助提取工藝及抗氧化活性，采用其他提取技術總黃酮得率如何，黃花草中總黃酮的開發利用還有待進一步研究。